Stres altındaki bazı bitkilerde biyoteknolojik önemi olan fenilalanin amonyum liyaz enziminin aktivitesinin belirlenmesi, optimizasyonu ve karakterizasyonu

Fenilketonuri hastalığı (PKU) otozomal resesif bir bozukluktur. Bu genetik bozukluk fenilalanin hidroksilaz (phenylalanine hydroxilase, PAH) enziminin, düşük seviyede olması nedeniyle fenilalanin aminoasidinin yüksek miktarlarda kan ve vücut sıvılarında birikmesi ile tanımlanır. Günümüzdeki araştırmalar PAH?ın alternatifi olduğu düşünülen fenilalanin amonyum liyaz (phenylalanine ammonia lyase, PAL) enzimi üzerine yoğunlaşmıştır. Çalışmada Ankara çevresi Beypazarı ilçesinden toplanan, tuz stresi koşullarında yayılış gösteren, endemik veya yaygın 13 bitki örneğinde PAL enzim ve spesifik aktivitesi taranmış ve bu sonuçlara göre PAL spesifik aktivitesi yüksek çıkan bitkilerle çalışmaya devam edilmiştir. En yüksek PAL spesifik aktivitesini Cyathobasis fruticulosa (64,9 U/mg), Salsola nitraria (55,3 U/mg), Salsola grandis (49,0 U/mg) ve Salvia halophila (47,8 U/mg) göstermiştir. Yüksek PAL spesifik aktivitesi gösteren C. fruticulosa ve S. nitraria?ya ait PAL enziminin optimizasyonu ve karakterizasyonu yapılmıştır. PAL enziminin optimum pH?sı 8,8, optimum sıcaklığı 37oC ve optimum tampon (Tris-HCl) konsantrasyonu 100 mM olarak belirlenmiştir (p<0,05). Yapay mide suyunda pH 4,0?de ve yapay bağırsak sıvısında pH 7,5?de enzimin aktivite kaybının en az olduğu görülmüştür (p<0,05). Bitkilerden elde edilen PAL enziminin optimum NaCl konsantrasyonu 200 mM olarak tespit edilmiştir (p<0,05). Her iki bitkiden de elde edilen PAL enzimi, oda sıcaklığında 2. günde, +4oC?de 5. günde, -20oC?de ise 12. ayda % 50?ye yakın aktivite kaybı göstermiştir (p<0,05). C. fruticulosa, S. nitraria, S. grandis ve S. halophila?dan elde edilen PAL enzimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (High pressure liquid chromatography, HPLC) kullanılarak L-fenilalaninin trans-sinnamik aside dönüşümü hem miktar hem de yüzde olarak tespit edilmiştir. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Jel Elektroforezi (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) ve Western Blot yöntemleri ile PAL enziminin kısmi saflaştırma sonrası, moleküler ağırlığı yaklaşık olarak 70 kDa bulunmuştur. Ayrıca kısmi saflaştırma sonrası yapılan HPLC analizi ile PAL enziminin aktivitesini kaybetmediği belirlenmiştir. Sonuç olarak bu tez çalışmasında, C. fruticulosa, S. nitraria, S. grandis ve S. halophila?dan elde edilen PAL enziminin aktivitesinin yüksek olması, farklı çevresel koşullarda aktivitesini kaybetmemesi, daha kararlı ve stabil olması, vücut sıcaklığı olan 37oC?de optimum çalışması, yapay mide suyu ve bağırsak sıvısında enzimin aktivitesini sürdürmesi bakımından öne çıkmıştır. Bu enzimin özellikle gıda ve ilaç endüstrisinde ürüne yönelik kullanımlarda öne çıkmasının ve biyoteknolojik ürünlerin üretiminde kullanılmasının mümkün olacağı düşünülmektedir.