28
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Romatoid artrit oluşum mekanizmasında yer alan PAD4 enzimini inhibe eden rekombinant peptidlerin geliştirilmesi
Amaç: Romatoid artrit patogenezinden sorumlu peptidil arjinin deiminaz 4 enziminin aktivitesini azaltmaya yönelik değişken ağır zincir (VH; variable heavy chain) yapıda rekombinant inhibitor geliştirmektir. Gereç ve Yöntem: PAD4 geninin E. coli'ye göre kodon optimizasyonu yapıldı ve sentezlettirildi. Sentezlenen PAD4 geni pET-30a vektörüne klonlandı ve E. coli BL21 (DE3)'e aktarıldı, PAD4 proteininin rekombinant üretimi gerçekleştirildi ve IMAC ile saflaştırıldı. Saflaştırılan PAD4 ile CD-1 fareler immunize edildi. İmmünize fare dalakları alındı ve total RNA izolasyonu yapıldı. Ardından, cDNA sentezi ve VH amplifikasyonu gerçekleştirildi. VH amplikonları çalışmada konstrüksiyonu gerçekleştirilen pComb3-hy vektörüne klonlandı ve E. coli XL1-Blue'ya aktarılarak VH kütüphanesi oluşturuldu. VH kütüphanesini içeren bakteri kültürü M13K07 fajı ile enfekte edildi ve VH gösteren faj kütüphanesi elde edildi. VH kütüphanesinden PAD4'e afinite gösteren VH gösteren fajlar panning ile seçildi. Afinite gösteren VH'ın sekans analizi yapıldı. Elde edilen VH4'ün amino asit sekansı kullanılarak üç boyutlu yapısı belirlendi ve PAD4 ile etkileşimini araştırmak için Alphafold ile modelleme yapıldı. VH4'ün PAD4'ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonu floresans tabanlı izleme ile in-vitro olarak test edildi. VH4'ün PAD4'ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonunun HeLa memeli hücre hattına morfolojik etkisi üzerinden değerlendirildi. VH4'ün sitotoksisite deneyi HeLa hücreleri ile WST-1 kullanılarak yapıldı. Bulgular: Çalışmada, koloni PCR ve sekans analizi sonucunda PAD4'ün klonlandığı doğrulandı. SDS-PAGE analizinde 75 kDa civarı bant eldesi neticesinde rekombinant PAD4 üretimi ve saflaştırılması doğrulandı. PAD4'e karşı oluşturulan VH gösterimi yapan faj kütüphanesinden PAD4'e afinite gösteren bir fajın kodladığı VH sekansı belirlendi. VH4 adı verilen bu peptidin moleküler ağırlığının 13 kDa ve in-silico olarak PAD4 ile 6 tane hidrojen bağı oluşturduğu gösterildi. In-vitro deneylerde VH4'ün PAD4 aktivitesini %30 azalttığı ve memeli hücre hattıyla yapılan in-vitro deneylerde PAD4 kaynaklı morfolojik bozukluğu önlediği ve sitotoksik etkiye sebep olmadığı gösterildi. Sonuç: Bu çalışmada sitrülinleme aktivitesi ile romatoid artritin patogenezinde önemli bir role sahip olan PAD4 enzimine karşı VH yapıda rekombinant inhibitor geliştirildi. Bu inhibitörün amino asit sekansı, üç boyutlu yapısı ve PAD4 ile etkileşimi gösterildi. Rekombinant PAD4 inhibitörü VH4'ün romatoid artrit tedavisinde kullanılma potansilyelinin belirlenmesi için hayvan modellerinde etkinliğinin test edilmesi dahil ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar Kelimeler: romatoid artrit, peptidil arjinin deiminaz (PAD), faj gösterim tekniği, rekombinant peptid
Development of recombinant antibiotics against Enterococcus faecium
Purpose: It was aimed to develop a recombinant antibiotic originating from the VH sequence of antibodies obtained from PBP5-immunized mice Materials and Methods: The gene encoding soluble PBP5 was cloned into the pET-30a(+) vector, produced recombinantly, and purified by IMAC. CD-1 mice were immunized with sol-PBP5, and the immune response was confirmed by ELISA. RNA from immunized mice spleens was used for cDNA synthesis and VH amplification. A VH-displaying phage library was created by cloning VH amplicons into pComb3-hy phagemid. Phages binding to sol-PBP5 were selected via biopanning, and their VH sequences were identified. The 3D structure of VH43 and its interaction with sol-PBP5 were modeled, and VH43 was produced recombinantly. Binding tests were performed with BOCILLIN-FL. Synergistic effects of VH43 with cephalosporin were tested using bacterial growth analysis and modified Kirby-Bauer/spot tests. Results: Cloning of sol-PBP5 into the pET-30a(+) vector was confirmed by sequence analysis. Expression and purification were validated via SDS-PAGE, with BOCILLIN-FL treatment confirming the protein's native conformation. Immunization was confirmed by ELISA (p-value = 9.02e-05). cDNA from total RNA of immunized mice spleens showed 500-600 bp bands on agarose gel. VH amplicons were cloned into the phagemid, and a phage library was produced via M13K07 infection. Affinity phages for sol-PBP5 were selected by biopanning, and VH sequences were determined after the third biopanning cycle. VH43's amino acid sequence and CDRs were identified, with a molecular weight of 10.3 kDa, 12 alpha helices, and 61 beta chains. Seven hydrogen bonds were found between VH43 and sol-PBP5. Recombinant VH43, confirmed via SDS-PAGE to be 20.3 kDa including His-tags, showed reduced brightness in BOCILLIN FL binding experiments. Combining VH43 with cephalosporin significantly inhibited bacterial growth, with increased zone diameter in modified Kirby-Bauer tests compared to cephalosporin alone. Conclusion: The increase in antibiotic-resistant E. faecium strains requires the development of new molecules. VH43 discovered in this thesis study is the first antibody/antibody fragment developed against E. faecium and whose sequence was determined. Combining recombinant VH43 with cephalosporin showed synergetic effect and significantly inhibited bacterial growth. This result underscores the potential of VH43 to enhance the effectiveness of cephalosporins that are normally ineffective, offering a promising approach for combating bacterial infections.
Mikroakışkan sistem ile eksozom izolasyonu ve kanser hücrelerini hedefleyen ilaç taşıyıcı sistem geliştirilmesi
Amaç: Meme kanserinde, üçlü negatif meme kanseri agresif ve klinik kötü prognoza sahip alt tipidir. Eksozomlar, hücrelerin haberleşmek amacıyla doğal olarak üretildikleri küçük boyutlu veziküller olup ilaç taşıyıcı sistem olarakda dikkat çekmektedir. Bu çalışmada Jurkat T-hücrelerinden salgılanan eksozomların mikroakışkan (MF) sistemle izole edilebilirliği ve eksozomlara paklitaksel (PTX) yüklemesinin meme kanseri üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Jurkat T-hücrelerinden eksozomlar salımı uyarılarak MF ve ultrasantrifüj ile izolasyonları yapıldı. Eksozomların boyut analizleri ve karakterizasyonları (CD63 ve CD81) yapıldıktan sonra elektroporasyonla PTX yüklendi. MDA-MB-231 hücreleri üzerinde Exo-PTX'in hücre canlılığı MTT yöntemi, apoptotik etkisi Annexin V-FITC-PI ve JC-1 boyaması ile flowsitometride analiz edildi. Exo-PTX'in migrasyon üzerindeki etkisi Boyden Chamber yöntemi ile ve kemokinler üzerindeki rolü CXCR4/CXCL12 gen ekspresyon analizi ile belirlendi. Bulgular: Jurkat T hücrelerinden izole edilen eksozomların boyutlarının 100 nm altında olduğu ve CD63 ve CD81 belirteçlerini taşıdığı belirlendi. Exo-PTX'in (10μg/mL) ve PTX'in (15 nM) ve üzerindeki konsantrasyonlarda hücre canlılıklarını anlamlı bir şekilde azalttığı, erken ve geç apoptozda ise anlamlı bir artış olduğu, migrasyon yeteneklerinin azaltığı CXCR4/ CXCL12'nin gen ekspresyon düzeylerini baskıladığı belirlendi. Sonuç: T lenfositleri gibi süspanse olan hücrelerin MF sistemlerde sabit boyutta eksozom izolasyonu büyük avantaj sağlayabilir. Jurkat eksozomları kemoterapik ajanların etkinliklerini korumaları ve hücre içerisine girişini sağlamak için metastazik kanserlerin tedavisinde kullanılabilir. Anahtar kelimeler: Eksozom, Jurkat T hücresi, Meme Kanseri, Mikroakışkan sistem, Paklitaksel
Aydın ili ve çevresindeki sıcak su kaynaklarında arke çeşitliliğinin belirlenmesi
Canlıların üç büyük domaininden birini oluşturan arkeler gerek biyokimyasal özellikleri gerekse yapısal özellikleri bakımından hem ökaryotlar hem de bakterilerden ayrılan prokaryotik hücre tipinde canlılardır. Arkelerin büyük çoğunluğu ekstrem ortam koşullarında metabolik ve moleküler adaptasyonları sayesinde hayatta kalabilmektedirler. Arke türlerinin saf kültürlerinin izole edildiği tipik ortamlar; kaplıcalar, hidrotermal bacalar, solfataralar, tuz gölleri, soda gölleri gibi habitatlardır. Son yıllarda, çevresel örneklerdeki 16S rRNA genlerinin PCR-bazlı amplifikasyonunu içeren moleküler tekniklerin kullanılması, kültürden bağımsız bir mikrobiyal çeşitlilik değerlendirmesine izin vermiştir. Bu çalışmada Aydın ili ve çevresindeki sıcak su kaynaklarındaki arkeal çeşitliliğinin kültürden bağımsız yöntemler kullanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Su, çamur ve birikinti örneklerinden total DNA izolasyonu yapılmış ve sonrasında, arke domainine spesifik primerler kullanılarak PCR yöntemi ile 16S rRNA gen bölgesi çoğaltılmıştır. Amplikonlar puc19 plazmidine yerleştirildikten sonra E.coli DH10B suşuna transformasyon yoluyla aktarılmıştır. Beyaz koloniler seçilerek, M13 primerleriyle PCR reaksiyonları kurulmuş ve elde edilen 16S rDNA amplikonlarının dizileri belirlenerek veri tabanındaki diğer prokaryotlarla olan benzerlik oranları saptanmıştır. Çalışmamızda bir tanesi kesim bölgeli olmak üzere 3 farklı primer çifti (751F/1406R- 25F/1492R- 1F/1000R) ve 2 farklı klonlama yöntemi (TA klonlama ve restriksiyon enzimi ile klonlama) kullanılmıştır. Elde edilen 112 klondan 45 tanesi bakteri (%40) ve 67 tanesi arke (%60) olmak üzere geniş bir çeşitlilik yelpazesi ortaya konulmuştur. Tespit edilen arkeleri ağırlıklı olarak hipertermofilik Ignisphaera aggregans ve Thermofilum türleri oluştururken, örneklerde Methanocaldococcus ve Methanospirillum cinslerine ait metanojenik üyelere de rastlanmıştır. Bakteri domainine ait klonlar ise Thermus türleri, siyanobakteriler ve Proteobakteri filumuna ait üyelerden oluşmaktadır. Ülkemizde sıcak su kaynaklarında arke çeşitliğinin belirlenmesi ile ilgili araştırmalar oldukça kısıtlıdır. Tez çalışmamız ekstrem mikroorganizmaların biyoteknoloji başta olmak üzere pek çok alanda popüler olduğu günümüzde ülkemiz biyoçeşitliliğine önemli katkı sağlayacaktır. Farklı PCR ve klonlama yöntemlerinin karşılaştırılması bu konuda çalışan araştırmacılar için yol gösterici olacaktır.
Bakteri yüzey gösterim tekniği ile rekombinant nükleaz enziminin saflaştırılması
Proteinlerin üretimini kolaylaştırmak ve verimini artırmak için rekombinant teknoloji sürekli geliştirilmektedir. Böylece düşük miktarda üretilen proteinlerin üretimleri artırılabilir ve bunun sonucu olarak maliyetleri düşer. Günümüzde rekombinant protein üretimi için sıklıkla kullanılan tekniklerden biri de gösterim tekniğidir. Gösterim tekniği ile füzyon proteinler hedeflenebilir ve hücre veya bakteriofajın dış yüzey proteinlerine eklenir. Gösterim tekniği yeni protein tasarlamada oldukça kullanışlıdır. Hücre içeriğindeki çeşitli proteinler arasından hedeflenen proteini izole etmek karmaşık bir işlemdir. Bu çalışmada gösterim tekniği, sentezlenen hedef protein streptodornazı saflaştırmada kullanılmıştır. Bu amaçla lpp, ompA ve spd1 genleri için primerler dizayn edilmiş, çoğaltılıp birleştirilen bu genler plazmide aktarılmış ve füzyon protein halinde E. coli'de sentezi sağlanmıştır. Ardından E. coli membranı izole edilmiş ve enterokinaz kesimi ile Spd1 enzimi membrandan ayrılmıştır. Membran proteinleri santrifüjle uzaklaştırıldıktan sonra Spd1 enziminin saflaştırıldığı SDS-PAGE yöntemiyle doğrulanmıştır. Sonuç olarak klinikte kullanım alanı bulunan streptodornaz enziminin bakteri gösterim tekniği ile saflaştırılması ve bu amaçla rekombinant olarak üretilmesi, diğer klasik saflaştırma prosedürlerine kıyasla oldukça hızlı ve düşük maliyette gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmamız kapsamında laboratuvarımızda geliştirilen bu yöntem, diğer pek çok hidrofilik, rekombinant protein için de kullanışlı olacaktır.
pRTA, yeni bir vektör ve TA klonlama: Bilinmeyen antibiyotik direnç genlerinin karakterizasyonu için yöntem
Antibiyotikler en yaygın kullanılan ilaçlar arasındadır. Enfeksiyonların tedavisinde kullanıldığı gibi besi hayvanları ve bitkilerin büyümelerini hızlandırmak amacı ile de kullanılmaktadır. Genellikle vücuttan atıldıktan sonra da aktif halde kalan antibiyotiklerin bilinçsiz kullanımı antibiyotik direncinin gelişmesinde önemli bir faktördür. Son yıllarda çoklu antibiyotik direncine sahip suşların görülme sıklığı ve yaygınlığı artmaktadır. Antibiyotik direncine sebep olan genlerin karakterizasyonu direnç sorununun ortaya konması ve mücadele yollarının belirlenebilmesi açısından önemlidir. Bu çalışmanın temel amacı antibiyotik direncine neden olan bilinen veya bilinmeyen genlerin klonlanmasına imkan veren bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, antibiyotik direnç genlerinin klonlanmasında oryantasyon sorunu yaşanmaması için çoklu klonlama bölgesinin her iki yönünden de ekspresyon sağlanabileceği vektör geliştirilmesi hedeflenmiştir. Oluşturulan pRTA vektörünün omurgası pUC19 vektöründen faydalanılarak invers PCR yoluyla elde edilmiştir. Dizayn edilen promotör ve RBS sekansı, vektör omurgasında hedeflenen lokasyona yerleştirilmiştir. Dual promotöre sahip vektörde promotör ve RBS'nin yerleşmesi ve fonksiyon gördüğünün belirlenmesi sekans analizi ve klonlama çalışmaları ile tespit edilmiştir. Geliştirilen klonlama yönteminde kullanılan 3'uçlarınında tek adenin bazı uzantısı bulunduran vektör, pRTA vektöründen PCR yoluyla elde edilen bir vektördür ve "AT vektörü" olarak adlandırılmıştır. Eritromisin direncine sahip S. aureus suşunun total DNA'sı fragmentaz enzimi ile rasgele parçalanıp istenen boyutlarda fragmentler oluşturulmuştur. Fragmentlerin 3' uçlarına AT vektörüne bağlanabilmesi için timin bazı eklendikten sonra fragmentler ve vektör ligasyonla bağlanmıştır. Oluşan ligand E. coli DH10B suşuna aktarılmış ve 200 μg/ml eritromisin içeren besi yerinde seçilmiştir. Çoğalan kolonilerdeki insertlerin sekans analizi yapıldığında direnç sağlayan genin ermC olduğu ve plazmid üzerinde taşındığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak dual promotöre sahip ve mavi-beyaz seçilime imkan veren bir vektör geliştirilmiştir. Geliştirilen bu vektörden elde edilen AT vektörü plazmid izolasyonuna kıyasla daha verimli şekilde PCR yoluyla elde edilmiştir. Klonlanacak direnç genlerini içeren fragmanlar fragmentaz enzimi ile rasgele lokasyonlardan parçalanarak direnç geninin içinden kesilme ihtimalini düşürmüştür. Ayrıca direnç geninin klonlanabilecek boyutta fragmanlar oluşturmasını sağlayarak klonlama başarısını arttırmıştır. Bu tezde, yeni bir vektör ve bilinen ve bilinmeyen direnç genlerinin klonlanması için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Servikal kanser için docetaxel yüklü eksozomların geliştirilmesi ve terapötik etkilerinin belirlenmesi
Serviks kanseri, rahim ağzı kanser olarak bilinir. Bu kanser türünün kadınlarda görülme sıklığı yüksek olmakla birlikte, kanserle ölümler arasında yaygın olarak görülmektedir. Serviks kanseri için kemaoterapiler kullanılmakta ve kombine ilaç tedavileri ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır. Farmasötiklerin nanopartiküller içerisine enkapsülasyonu; kontrollü salım sağlanması, ilaç toksisitesini azaltması ve istenilen bölgeye hedeflendirilebilme özellikleri sayesinde kanser tedavisinde yaşanan problemlere çözüm sunmaktadır. Eksozomlar, hücrelerin kendi yapılarından salınan nano boyuttaki veziküllerdir. Eksozomların, çeşitli hücrelere proteinleri, RNA' ları, biyomolekülleri transfer edebileceği gösterilmiştir. Eksozomlar ilaç dağıtımı için seri üretilebilir bir kapasiteye sahip olup, tümör büyümesini baskıladığı konusunda da çalışmalar yer almaktadır. Bu tez çalışmasında bir mikrotübül inhibitörü olan kemoterapide kullanılan docetaxel' in, eksozomlar içerisine yüklenip yeni bir taşıyıcı sistem geliştirilerek, serviks kanseri için terapötik etkileri araştırıldı. Çalışmada serviks kanser hücreleri olan HELA' dan salınan eksozomlar izole edildi ve eksozomlara elektroporasyon yöntemiyle docetaxel yüklendi. Yükleme yapılan eksozomların karakterizasyon çalışmaları (partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli ve enkapsülasyon etkinliği) yapıldı. Sitotoksisitenin belirlenmesi için MTT yöntemi kullanıldı. Uygun doz belirlendikten sonra servikal kanser tedavisi için hücrelere uygulandı. Docataxel yüklü eksozomların migrasyon üzerine etkisi strach testi yapıldı. Apoptoz üzerine etkilerini anlamak için Bax, Bcl-2, Pro kaspaz-3 ve Pro kaspaz-9 proteinlerinin hücre içi ifadeleri Western blot yöntemi kullanılarak saptandı. Gen ifadeleri üzerine etkisi ise RT-PCR yöntemi ile saptandı. Yapılan çalışmalar sonucunda docetaxel yüklü eksozomlar, docetaxel çözeltisine göre daha yüksek sitotoksik etkiye yol açmıştır. Çalışmalar, docetaxel yüklü eksozomların kanser tedavisinde yeni bir yol olabileceğini göstermiştir.
Development of aptamer based CD62 diagnostic kit
Disease-specific biomarkers consider as important tool for the pathological conditions efficient management, including susceptibility determination, diagnosis, and preventive monitoring efficacy. P-selectin is selectively expressed after platelets activation, and it is involved in formation of thrombus, and also in immune response. It is known that serum and plasma p-selectin (CD62) levels increase in some pathological conditions such as heart attack, stroke, some immune diseases and cancer. To date, a lot of methods have been developed to measure p-selectin level. Aptamers use for targeting specific biomarkers on their molecular shape the basis. SELEX (The Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) is a process which uses to choose aptamers with high affinity for targeting specific macromolecular. In this study, a new aptamer-based kit was developed to measure CD62. Firstly, aptamers that specifically bind to CD62 were isolated using the SELEX method. Among the used aptamers, Apt-1, Apt-2 and Apt-3 were bound to CD62 protein with high affinity. The Apt-2, which binds with the highest affinity to CD62, the binding constant is -9,6 kcal/mol and dissociation constant (Kd) is 18.15±2.36 nM. We used Bovine serum albumin in the specificity test as a negative control and it was determined that there is no binding between the selected aptamers did not and this protein. The Intra and Inter assay performing showed that the average of Intra-assay was CV % 6,52 and the average of Inter-assay CV % 3,96. As a result, a sensitive, specific, time-saving and low cost kit was developed for the measurement of CD62 with this study
Çevresel örneklerden Escherichia coli DH10B suşuna karşı litik bakteriyofaj izolasyonu ve klinik Escherichia coli suşlarına karşı etkinliklerinin belirlenmesi
Doğada en fazla bulunan biyolojik topluluğu temsil eden bakteriyofajlar bakterileri enfekte eden virüsler olarak tanımlanmaktadırlar. Bakteriyofajların en iyi bilinen özelliklerinden biri tür spesifik olmalarıdır. Yeni antibiyotiklerin üretiminde yaşanan krizler ve Dünya genelinde artan antibiyotik kullanımından dolayı dirençli bakterilere karşı antibiyotik tedavisine alternatif bir yaklaşım arayışı gündeme gelmiştir. Buna paralel olarak, aslında 100 yıldır var olan bakteriyofajların tedavi amaçlı kullanımı (Faj Terapi) günümüzde tekrar bilim ve tıp dünyasının ilgi odağı haline gelmiştir. Dünya sağlık örgütü (DSÖ) tarafından günümüzde hastane ve toplum etkenli tedavisi zor enfeksiyon hastalıklarının en önemli etmenleri arasında patojenik Escherichia coli gösterilmektedir. Bu tez kapsamında; çevresel örneklerden E. coli DH10B suşuna etkili litik bakteriyofajların izolasyonu ve diyabetik ayak enfeksiyon (DAE) kökenli Escherichia coli izolatlarına karşı etkinliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında plak morfolojileri farklı 15 bakteriyofaj izole edilmiş ve restriksiyon endonükleaz profilleri belirlenmiştir. Kesilen 9 fajdan 4 farklı faj profili saptanmış ve kesilmeyen 6 faj arasında E. coli suşları üzerine etkilerine bakılarak 3 farklı faj biyotipi olduğu belirlenmiştir. Farklı profildeki fajlar KK1'den KK7'e kadar kodlanmış ve çalışmaya dâhil edilen 30 klinik izolata karşı etkinlikleri test edilmiştir. En yüksek litik aktiviteye sahip KK4 fajının izolatların 22'sine (%73) etkili olduğu ve tüm fajların karışımından hazırlanan kokteylin 3 izolat hariç tüm bakterilere etki ettiği belirlenmiştir (%90). İzole ettiğimiz fajlar da dahil olmak üzere fajların tedaviye yanıt vermeyen enfeksiyonlar için antibiyotiklerle birlikte kullanılabilme potansiyeli vardır. Özellikle klinik E. coli izolatlarının %73'üne etkili olduğu tespit edilen KK4 fajının bu amaçla kullanılma potansiyeli yüksektir.
Cloning of beta hemolysin gene from coagulase-negative staphylococci and testing of biological activity
Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are differentiated from the closely related but more virulent Staphylococcus aureus by their inability to produce free plasma coagulase. Coagulase-negative staphylococci are common etiologies of bacteremia that are resulted from intravascular device infections. They now represent one of the major nosocomial pathogens in clinical microbiology laboratories with S. epidermidis and S. haemolyticus being the significant species. Beta hemolysin (hlb) serves as an important virulence molecule involved in the pathogenesis of S. epidermidis. This cytotoxin has two distinct mechanisms of action; Sphingomyelinase activity and DNA bio-film ligase activity (i.e. the ability of β-toxin to cross-link itself in the presence of exogenous DNA). In this study, strains of S. epidermidis cultured from foot infections from diabetic patients were used. Primers with attached KpnI and EcoRI restriction sites were designed to amplify the hlb gene. The gene was subjected to cloning using pUC19 plasmid as a vector. After cloning, the amplicon obtained by M13 PCR was sent for confirmation by sequencing. From the sequence result, a percentage similarity rate of 98.95% of (Staphylococcus epidermidis strain Q47 sphingomyeline phosphodiesterase) was confirmed as expected. The recombinant protein was tested on a sheep blood agar which showed hemolysis of erythrocytes.
Hücre membranından geçemeyen ajanların antiproliferatif etkilerinin nanoenkapsülasyon ile modifikasyonu
Amaç: Bu çalışmada amaç hücre membranından geçemeyen ajanların düşük dozlarda nanoenkapsülasyonla hücreye girmesini sağlamaktır. Gereç ve Yöntem: Bunun için araştırma materyali olarak hidrojen soy fosfatidilkolin ve kolesterol lipitleri toz halinde satın alınmıştır. Bu tozlar 3:1 kloroform/metanol içinde çözündürüldükten sonra vakum altında kloroform/metanol uzaklaştırılmıştır. Elde edilen lipit tabakası sitrat tamponu içinde lipozom enkapsüle edilecek toksik kimyasallar ile homojen hale getirilip filtreden geçirilerek lipozom elde edilmiştir. Son aşamada bu karışım kolondan geçirilerek lipozom enkapsüle olmayan kimyasallardan arındırılmış ve lipozomlar saf halde elde edilmiştir. Bulgular: Elde edilen lipozomların boyutları yaklaşık 200-300 nanometre boyutundadır. DTPA ve TPEN ile yüklenen lipozomların enkapsülasyon verimi hesaplanmıştır. DTPA'nın paketlenme verimi %43,8, TPEN'in paketlenme verimi %1,45 bulunmuştur. DTPA'nın PC3 hücreleri üzerinde IC50 değeri 48 saatte 50 µM olarak bulunmuştur. TPEN'in PC3 hücreleri üzerinde IC50 değeri 24 saatte 4-6 µM arasında olduğu saptanmıştır. Sonuç: Lipozomal DTPA'nın PC3 hücreleri üzerinde IC50 değeri 72 saatte 50-60 µM olarak değerlendirilmektedir. Lipozomal TPEN'de ise bu değerin 72 saatte 6-8 µM arasında olduğu sonucuna varılmıştır. Yalın DTPA ya da TPEN'in toksik etkisinin lipozomal formülasyonlarından daha fazla olduğu sonucu elde edilmiştir.
Fare alfa klotho proteininin fotosentetik mikroalg Chlamydomonas reinhardtii'de heterolog ekspresyonu
Klotho (Kl) has been described as a powerful inhibitor of aging and a multifunctional regulatory protein. Klotho has been reported that homozygous mice with the mutant klotho allele show the typical aging phenotypes of atherosclerosis, ectopic calcification, pulmonary emphysema, skin atrophy and osteoporosis. It has been scientifically proven that mice that produce excess Klotho protein increase their lifespan by 30%. The antagonistic effect of Klotho protein on different types of cancer has been scientifically proven. It was observed that the amount of liberated KL (secreted KL: sKL) in blood system is significantly decreased in cancer patients and that external sKL supplementation has curative effects on most chronic diseases, including cancer types. In the next 5-10 years, many cancers, including diabetes, Alzheimer's, Parkinson's, arteriosclerosis, heart failure, high blood pressure, kidney failure, etc. It seems inevitable to supplement SKL for treatment and protection against diseases. In this study, the gene encoding mouse α-Klotho protein was cloned into the pCAMBIA1301 vector and then transferred to Agrobacterium tumefaciensis EHA105 cell lines. The mouse α-klotho gene was transferred to Chlamydomonas reinhardtii (CC-124) microalgae hosts by Agrobacterium-based transformation method. Positive transformants of CC-124 cells were selected on TAP agar media containing 30 µg/ml hygromycin antibiotics throughout three consecutive generations. Upon the isolation of genomic DNA from transformed microalgae, the molecular confirmation of transformed α-klotho gene in microalgae genome was performed by PCR amplification of the corresponding DNA region. Later, extracellular production of the mouse α-Klotho protein by transformed microalgae host cells was induced in liquid TAP medium. The successful production of α-Klotho protein in culture medium was then confirmed through the purification processes and following SDS-PAGE analysis. The functionality of the purified protein and its anti-carcinogenic effect were tested in two different cancer cell lines through MTT tests measuring the cell viability in mammalian cell lines. In conclusion, the recombinant production of the pharmaceutical α-Klotho protein was successfully carried out for the first time in model microalgae C. reinhardtii hosts extracellularly. In this way, the basis was established for the photosynthetically low-cost production of α-Klotho protein and this will definitely facilitate the accessibility of the Klotho protein for different medicinal applications for human health in near future.
Extracellular expression of Ideonella sakaiensis PETase mutant in photosynthetic microalga Chlorella vulgaris
The first PET degrading enzyme was first identified in 2017. Subsequently, various enzyme engineering studies were carried out on PETase enzyme. Three different mutations were determined from two different studies with high activity improvement, and combined within one PETase aa sequence. After being evaluated through in silico modeling and molecular docking analysis, their integration into the encoding nucleotide sequence of PETase enzyme was performed. Subsequently, the newly created PETase DNA fragment was commercially synthesized as a synthetic gene and called as PETase3M. Upon PCR amplification, PETase3M was cloned into the pJET1.2 cloning vector for long term maintenance. The corresponding DNa fragment of PETase3M enzyme was transferred into the expression vector pOPT_cCA_mRuby2_Paromy for expression in microalgae hosts. In this vector, PETase3M DNA fragment was positioned behind the HSP70/RBCS2 fusion promoter system. For this task, native DNA region encoding Red Fluorescent Protein (RFP) in pOPT_cCA_mRuby2_Paromy vector was removed using BglII and EcoRI restriction enzymes, and the DNA fragment of PETaz3M was ligated into this place. In this way, the DNA fragment encoding PETase3M was integrated between HSP70/RBCS2 promoter and the 3' untranslated region (3'UTR), making it ready for transformation into eukaryotic microalgae. Transformation of C. vulgaris microalgae cells with recombinant pOPT_cCA_mRuby2_Paromy_PETase3M vector was performed by a modified electroporation process. PETase3M positive transformants of C. vulgaris 211/11J cells were selected for three consecutive generations on TAP agar containing 50 µg/ml paromomycin. The presence of PETase3M insert within microalgae nuclear genome was confirmed through the amplification of PETase3M gene by PCR. Upon His tag based prufıication, the successful and extracellular expression of recombinant PETase3M in C. vulgaris transformants was confirmed by SDS-PAGE analysis of microalgae culture medium. PET films treated with purified PETase3M and degraded to a certain degree under light microscopy. In conclusion, extracellular and functional production of a PETase3M mutant was carried out in C. vulgaris with high tolerance to extreme conditions for the first time. Thus, the devloped microalgae strain could find extensive utilizations in large-scale bioremediation and recycling applications of environmental PET wastes photosynthetically.
Kanser tedavisi için protein mühendisliği yaklaşımları ile geliştirilmiş anti-vegf antikorlarının araştırılması
Monoclonal antibodies (IgGs) are powerful therapeutics for many diseases, including cancer, due to their high specificity and other favorable properties. However, their large size limits their penetration into large masses of biological tissue, such as solid tumors. The single-chain variable fragments (scFvs), on the other hand, have better tissue penetration due to their smaller size. Yet, due to the absence of constant domains, scFvs are not as thermally stable as their parental IgGs or even Fab (fragment antigen-binding) fragments, which poses a challenge for therapeutic applications. Therefore, in this thesis, we aimed to develop a general method for increasing the thermal stability of scFvs. Anti-angiogenic therapy has a critical importance in tumor-mediated angiogenesis, which is a hallmark of solid tumors. Bevacizumab (IgG) was the first therapeutic developed for anti-angiogenic therapy, and it is still used in the clinic for a variety of solid tumor types, mostly in combination with chemotherapy. In this thesis, we developed anti-VEGF scFvs derived from bevacizumab and they demonstrated better anti-angiogenic efficacy compared to bevacizumab on a transgenic zebrafish model. Next, by utilizing rational design approaches including computational methods, and directed evolution techniques including yeast surface display we obtained thermally more stable scFv variants, the highest of which has around 10 ºC higher transition mid-point (T1/2) compared to wild type scFv. This method described in this thesis can be used to improve the thermal stability of any kind of antibody or antibody fragment.
Hesaplamalı yöntemler kullanılarak beyin neoplazmasında prognoz ve teşhis işaretlerinin belirlenmesi
Low-grade gliomas (LGG) are central nervous system Grade I tumors, and as they progress become one of the deadliest brain tumors. Today, there is still great need for timely and accurate diagnosis and prognosis. The aim of this study, was to identify diagnostic and prognostic biomarkers associated with LGG, by employing using diverse computational approaches. For this purpose, differential gene expression analysis between LGG tissue and corresponding normal tissue was performed by using three methodologies. A total of four thousand four hundred and ninety six common differentially expressed genes (DEGs) between LGG and healthy brain tissue were detected. Next, those DEGs were used to conduct Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) in order to identify clusters of co-expressed genes. In this way, two modules significantly correlated with clinical traits were detected. The DEGs comprising the modules were further used to construct gene co-expression and protein-protein interaction networks. Based on this analysis, we derived a consensus of eighteen hub genes, namely, CD74, CD86, CDC25A, CYBB, HLA-DMA, ITGB2, KIF11, KIFC1, LAPTM5, LMNB1, MKI67, NCKAP1L, NUSAP1, SLC7A7, TBXAS1, TOP2A, TYROBP, and WDFY4. All detected hub genes were up-regulated in LGG, and were also associated with unfavorable prognosis in LGG patients. These findings could be applicable in the clinical setting for diagnosing and monitoring LGG.
Nörotrofin reseptörü ile ilişkili ölüm bölgesi proteininin Wnt/ β - katenın sinyal iletiminin düzenlenmesindeki rolünün zebrabalığı embriyonik modeli ve CRISPR/Cas9 knockout modeli ile araştırılması
Wnt/β-catenin signaling pathway plays essential roles in many biological processes including cell proliferation, migration, differentiation and apoptosis during development and adulthood. Many regulatory molecules of the pathway were revealed by researchers over the years. Yet, the whole mechanism is a puzzle with missing pieces, waiting to be solved. In this study, we identified neurotrophin receptor-associated death domain (nradd), a homolog of p75 neurotrophin receptor (p75NTR), as a negative feedback regulator of Wnt/β-catenin signaling in zebrafish embryos. We revealed that nradd overexpression significantly suppresses Wnt8-mediated/β-catenin signaling which controls mesoderm and neuroectoderm patterning during gastrulation. Also, its overexpression suppresses the expression of Wnt-target genes: Lymphoid Enhancer Binding Factor 1(Lef1), Sp5 transcription factor-like (Sp5l), and conductin (Axin2) and can rescue the effect of high Wnt8-mediated/β-catenin signaling activity, loss of forebrain and eyes. In addition, we investigated nradd F0 knockout model generated by CRISPR/Cas9 gene-editing. To observe nradd loss-of-function efficiently in F0 embryos, we injected Cas9 protein with 4 guide RNAs targeting nradd gene to one-celled embryos. Our approach is significantly suppressed nradd expression in F0 crispants. In crispants, Wnt-target genes' expressions are significantly upregulated, supporting the negative regulator role of Nradd in Wnt/β-catenin signaling. Moreover, we also analyzed the apoptosis level in crispants to evaluate the defined apoptotic function of nradd by previous studies. Interestingly, we observed an increased apoptosis level in crispant embryos at 24 hours-post-fertilization (hpf), confirmed by increased expression level of pro-apoptotic genes and increased immunoreactivity of cleaved-caspase-3 antibody. In summary, Nradd acts as a negative feedback modifier of Wnt/β-catenin signaling and a regulator of cell death during embryonic development. As the pathway modifiers serve as attractive drug targets especially in targeted therapies for cancer, further characterization of Nradd at the molecular level will significantly contribute to both elucidations of as yet unknown pathway mechanisms and the discovery of novel drugs targeting the pathway.
Ekzozomal miR-34a Aracılığıyla Mikroglia – Nöron Etkileşimi
Microglia are extra-embryonic yolk sac-derived myeloid cells in the Central Nervous System (CNS) playing roles in regulating brain development, repairing injuries and maintaining neuronal networks. When signaling dangers to CNS by dead cells, microbes, unnecessary synapses and soluble antigens, they remove them and maintain homeostasis. Because of being the primary source of proinflammatory cytokines, microglial cells mediate neuroinflammation and regulate cellular responses that have extensive spectrum. Exosomes are membrane-encapsulated vesicles that are released via various cell types. They have functions in regulating cell-to-cell transmission via carrying their cargo to recipient cells containing microRNAs (miRNAs), mRNAs, proteins and DNA. Microglia-derived exosomes promote neural regeneration by stimulating neurite outgrowth and might have a role in neurological disorders. MiRNAs within exosomes have functional roles when being delivered into the recipient cells and are thought to be the key functional elements. The aim of this thesis is to identify the impacts of microglial cells on neuronal cells via exosomal miR-34a. As a requirement of this purpose, SH-SY5Y neuronal cell line will be treated with different concentrations of hydrogen peroxide (H2O2) and its cytotoxicity will be evaluated via LDH (Lactate Dehydrogenase) assay and PI (Propidium Iodide) visualization. Then, the cytotoxic effect of hydrogen peroxide on neurite outgrowth will be determined by assessing the number of protrusions per cell, and neurite lengths will be analyzed and expressed as mean process length. After that, HMC3 microglial cell line will be transfected with miR-34a mimic and their exosomes will be given to SH-SY5Y cells. The impacts of miR-34a on SH-SY5Y cells in terms of neuroprotection will be determined.
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV) muhtemel kaspaz orf'si̇ni̇n (AMV063) fonksi̇yonel anali̇zi̇
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV), tarımsal açıdan önemli zararlıları enfekte ettiği için, AMEV'nin genomunda yapılan genetik mühendisliği çalışmalarıyla hem bu virüslerin biyoteknolojik ajan olarak kullanımının artırılması amaçlanmakta hem de henüz keşfedilmeyen gen fonksiyonları aydınlatılmaktadır. AMEV'nin, LD652 ve CF-70-B2 gibi böcek hücre hatlarını enfekte edilebildiği ve viral yaşam döngüsünü devam ettirmek için apoptozise sebep olduğu gösterilmiştir. Kaspazlar, sistein proteaz ailesinin üyeleridir ve apoptozisin düzenlenmesinde önemli rollere sahiptir. AMEV'ye ait muhtemel kaspaz proteinini kodladığı belirlenen 63. ORF'nin, AMEV protein kinazlarıyla etkileşimi belirlenmiş olmasına rağmen, AMV063 proteininin apoptozis ve kaspaz aktivitesi daha önce araştırılmamıştır. Bu tez kapsamında, AMEV063 ORF'sinin fonksiyonel analizi yapıldı. AMV063 proteini prokaryotik sistemde ifade edildi. Homolog rekombinasyonla AMV063 dizisi silinen nakavt Am∆063/gfp oluşturuldu. Apoptozise duyarlı CF-70-B2 hücreleri, AMV063 proteini ve Am∆063/gfp kombinasyonları ile muamele edilerek apoptozis ve kaspaz-2 aktiviteleri araştırıldı. AMV063 proteini ile muamele edilen CF-70-B2 hücrelerinde, kaspaz-2 ve TUNEL aktivitesi belirlenemedi. Am∆063/gfp virüsü ile muamele edilen CF-70-B2 hücrelerinin kaspaz-2 ve TUNEL aktivitesi, kontrol Am∆sph/gfp virüsü ile muamele edilenlere göre önemli derecede azaldı. Bu sonuçlar, AMV063 dizisinin kaspaz-2 proteinini kodladığını ve doğal sisteminde üretilen AMV063 proteininin, kaspaz-2 ve apoptozis aktivitesine sahip olduğunu açık bir şekilde gösterdi. Anahtar Kelimeler: Böcek virüsleri, Amsacta moorei entomopoxvirus, AMV063, Am∆063/gfp, kaspaz-2, apoptozis
Investigation of the effect of recombinant panton valentine lökosidin (PVL) toxin on prostate cancer cell line
Objective: The aim of this study is to generate the cytotoxic Panton-Valentine lökosidine (PVL) using recombinant technology and to examine its effect on the prostate cancer cell line. Materials and Methods: Primers to amplify LukS-PV and LukF-PV genes separately and together were designed according to genebank (NCBI CP084892), Amplified fragments were cloned into the pET30a(+) expression vector. Cloned fragments were confirmed by sequence analysis and used to obtain recombinant proteins. The synthesized proteins were purified partially and their effects on macrophages were investigated. Then, the cytotoxic effect of LukS and LukF seperatelly and together were tested on the normal prostate cell line (RWP-1) and prostate adenocarcinoma cell line (PC3). Cytotoxic effects were measured with the WST-1 test and the results were evaluated. Results: Recombinant LukS-PV and LukF-PV and in combination were obtained. Then, their effects on macrophages were examined, it was seen that rPVL and LukS-PV had cytotoxic effect on macrophage, but LukF-PV had no effect. When applied to prostate normal cell line (RWP-1) and adenocarcinoma cell line (PC3), the recombinant products obtained did not have any cytotoxic effect on either cell line. Conclusion: Although Panton Valentine Lökosidin had sitotoxic effect on macrophage cell line, no sitotoxic effect was observed on prostate normal cell line (RWP-1) and adenocarcinoma cell line (PC3).
Kronik tinnitusta BDNF (beyin kaynaklı nörotrofik faktör) genini regüle eden miRNA polimorfizmlerinin araştırılması
MikroRNA'lar (miRNA'lar), hedef mRNA'larının translasyonuna müdahale ederek gen ekspresyonunu transkripsiyon sonrası düzenleyen küçük kodlayıcı olmayan RNA'lardır. Tipik olarak miRNA'lar, baskı veya bozulmayı indüklemek için mRNA'ların 3' UTR'lerine bağlanır. Nöroplastisite açısından önemli faktörlerden birisi olan beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) nöronların büyümesi, farklılaşması, yaşamlarını sürdürmesinde ve iç kulak duyu epitelyumu dahil gelişmekte olan işitsel yolda anahtar rol oynayan nörotrofik faktörlerden biridir. Nörotrofik faktörler sadece miRNA'lar tarafından düzenlenmez, aynı zamanda miRNA ekspresyonunu da düzenlerler. Biriken veriler, BDNF ve miRNA'lar arasında düzenleyici bir negatif geri besleme döngüsü olduğunu gösterir. Yani, BDNF tedavisi nöronal miRNA ekspresyonunu uyarırken miRNA'lar genellikle BDNF ekspresyonunu inhibe etme işlevi görür. Bu negatif geri besleme döngüsü, normal hücrelerde bir denge durumunda korunur. Bu anlamda BDNF'yi regüle eden miRNA'lar da işitsel yolu etkileyebilir ve insanlarda işitme performansı üzerinde etkili olabilecek aday gen polimorfizmleri olabilir. Tinnitus ile BDNF arasındaki ilişki bilinirken, literatürde tinnitus ile BDNF` yi regüle eden miRNA polimorfizmleri arasındaki ilişkiyi sorgulayan bir çalışma mevcut değildir. Bu nedenle bu çalışmada BDNF`yi regüle eden miRNA polimorfizmlerinin tinnitus patofizyolojisindeki yerini ortaya koymak amaçlanmıştır. Bu amaçla çalışmaya, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi KBB polikliniğine başvuran en az 3 aydır tinnitus yakınması olan ve tinnitus tanısı almış 18-55 yaş aralığında 70 olgu ile yine KBB polikliniğine başvuran ve tinnitus semptomu ile bir sistemik hastalığı bulunmayan aynı yaş grubunda 70 kontrol grubu dahil edildi. Tinnitus değerlendirmesi için olgulara timpanometrik ve odyolojik değerlendirme, tinnitus parametreleri ile psikoakustik değerlendirmeleri yapıldı ve olgulardan 2cc periferik kan alındı. Alınan periferik kanlarda tinnitusla ilişkili BDNF genini regüle eden 5 adet miRNA SNPlerine mir30e (112439044), mir30e (rs10489167), mir206 (rs16882131), mir30a (rs1491500379), mir26b (rs565919718) SNPType metodu ile Fluidigm platformu kullanılarak Real Time PCR bakıldı. Data analizi Fluidigm SNP genotyping analysis version 4.1.3 (Fluidigm, South San Francisco, CA, USA) kullanılarak yapıldı. Tinnitus ve kontrol grubu ile mir30e 112439044 C-T ve mir206 rs16882131 C-T polimorfizmi genotip dağılımı açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir farklar saptanmıştır (p=0,03 ve p=0,01). İki grup ile mir30e 112439044 C-T polimorfizmi allel frekansı açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmıştır (p=0,05). Sonuç olarak mir206 rs16882131 ve mir30e 112439044 polimorfizmleri işitsel yolu etkileyebilir ve bu etkiyi BDNF gen ekspresyonunu regüle ederek gösterebilir. Anahtar Kelimeler: Kronik tinnitus, BDNF geni, BDNF geni regüle eden miRNA'lar
Kronik tinnitusta bdnf (beyin kaynaklı nörotrofik faktör) val66met polimorfizmi ile bağlantılı bdnf antisense rna polimorfizmlerinin araştırılması
Tinnitus, dışarıdan herhangi bir uyarı olmaksızın kişinin kulağında veya başının herhangi bir bölgesinde ses algılamasıdır. Nöral plastitede önemli faktörlerden birisi olan beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) işitsel yolun gelişiminde anahtar rol oynayan nörotrofik faktörlerden biridir. BDNF geni, genin downstream yönünde konumlanan uzun kodlama yapmayan bir BDNF antisens RNA geni (BDNF-AS) ile düzenlenir. Bu nedenle, hem BDNF ve BDNF-AS işitmede etkili olabilecek aday gen lokusları olabilir. Literatürde tinnitus ile BDNF Val66Met polimorfizmi ile arasındaki ilişki gösterilirken, BDNF Val66Met polimorfizmi ile bağlantılı BDNF-AS polimorfizmleri ile ilişkisini sorgulayan bir çalışma mevcut değildir. Bu nedenle bu çalışmada BDNF Val66Met polimorfizmi ile linkage disequilibrium gösteren BDNF-AS polimorfizmlerinin tinnitus patofizyolojisindeki yerini incelemek amaçlanmıştır. Bu çalışmaya, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi KBB polikliniğine başvuran en az 3 aydır tinnitus yakınması olan 85 olgu ve tinnitus semptomu ile bir sistemik hastalığı bulunmayan 60 olgu dahil edilerek ve olgulardan 2cc periferik kan alındı. Alınan periferik kanlardan toplam 6 BDNF-AS polimorfizmlerine (rs925946, rs10501087, rs1488830, rs4074134, rs1519480, rs10767658) Fluidigm SNPType metodu ile bakıldı. Tinnituslu hastalar ve kontrol grubu ile BDNF-AS rs925946, rs10767658, rs1519480 polimorfizmleri genotip dağılımı karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklar saptanmıştır (sırasıyla p=0,020, p=0,002, p=0,002). rs1519480 polimorfizmi için allel frekansları karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmıştır (p=0,009). rs925946, rs10767658, rs1519480 ve rs1488830 polimorfizmleri tinnitus süresi ile
Alzheimer tipi demans ile BDNF (beyin kaynaklı nörotrofik faktör) genini düzenleyen mikrorna polimorfizmleri arasındaki ilişkinin araştırılması
ALZHEİMER TİPİ DEMANS İLE BDNF (BEYİN KAYNAKLI NÖROTROFİK FAKTÖR) GENİNİ DÜZENLEYEN MİKRORNA POLİMORFİZMLERİ ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Tuna A. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoteknoloji Programı, Yüksek Lisans Tezi, Aydın, 2023. Amaç: Alzheimer tipi demans, nöron kaybı ve defektleriyle ilişkili bir nörodejeneratif hastalıktır. BDNF (Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör), nöronların hayatta kalması ve fonksiyonu için önemlidir ve Alzheimer dahil nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. MikroRNA'lar (miRNA'lar), BDNF genide dahil gen ekspresyonunun düzenlenmesinde hayati bir rol oynayan küçük, kodlayıcı olmayan RNA molekülleridir. Biriken veriler, BDNF sentezinin miRNA'lardan etkilenebileceğini, aslında BDNF ve miRNA'lar arasında düzenleyici bir negatif geri besleme döngüsü olduğunu göstermektedir. Bu açıdan araştırmamızda, Alzheimer tipi demans hastalarında BDNF genini düzenleyen miRNA polimorfizmlerinin araştırılması amaçlanmaktadır. Gereç ve Yöntem: Çalışmaya Aydın Devlet Hastanesi Psikiyatri polikliniğine başvuran 70 Alzheimer Tipi Demans hastası ile yine Psikiyatri polikliniğine başvuran ve Alzheimer tipi Demans ile başka nörodejeneratif hastalığı bulunmayan aynı yaş grubunda 70 sağlıklı birey dahil edildi. Çalışmada, Entegre Akışkan Devre (IFC) tabanlı bir BioMark teknolojisi kullanılarak nanolitre hacimlerinde reaktiflerle genotipleme yapıldı. Fluidigm tarafından geliştirilen SNPType Paneli, hasta ve kontrol grubumuzun DNA örnekleri üzerinde 5 ilişkili miRNA bölgesini incelemek için kullanıldı. Bulgular: Alzheimer tipi demans ve kontrol grupları arasında cinsiyet ve yaş bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. Alzheimer tipi demans grubu ile kontrol grubunun karşılaştırılması sonucu miR-206, miR-30e, miR-26b polimorfizmlerinin genotip dağılımında ve miR-30e ve miR-206 polimorfizmlerinin allel frekanslarında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar görüldü (p <0,05). Sonuç: Araştırmamızın potansiyel sonuçları, Alzheimer tipi demansın mekanizmalarını anlamaya yönelik bilgi sağlayabilir ve miRNA polimorfizmlerini biyobelirteç olarak kullanarak Alzheimer predispoziyonu belirleme ve demans alt tiplerini ayırt etme konusunda katkıda bulunabilir. Ayrıca, miRNA'lar ve BDNF arasındaki ilişkinin terapötik etkilerini araştırarak Alzheimer hastalığına profilaktik etkili hedefli tedaviler geliştirilebilir. Anahtar kelimeler: Alzheimer tipi demans, Alzheimer hastalığı, BDNF geni, BDNF genini regüle eden miRNA'lar, SNPType Assay
Rekombinant MrkD proteininin fibroblast hücresine ve kolajene adezyondaki rolünün belirlenmesi
Amaç: Bu tezde, rekombinant olarak üretilen MrkD proteininin insan fibroblast hücreleri ve kolajenle olan etkileşimi moleküler düzeyde incelenmiş, bu proteinin potansiyel terapötik hedef olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Rekombinant DNA teknolojisi ile K. pneumoniae'nin mrkD geninin çoğaltılması için primerler tasarlanmış ve çoğaltılan gen pET30a(+) ekpresyon vektörüne klonlanmıştır ardından E. coli BL21 hücrelerine transforme edilmiştir. MrkD proteini IMAC yöntemi ile saflaştırılmış, fibroblast hücre hattına karşı sitotoksitesi ve K. pneumoniae'nin hücreye bağlanabilme potansiyelindeki etkisi incelenmiştir. Ayrıca MrkD proteininin Tip V kolajen ile olan etkileşim değerleri ELISA yöntemi ile ölçülmüştür. Bulgular: Saflaştırılan MrkD proteininin boyu 40.8 kDa olarak hesaplanmıştır. MrkD proteinin tip V kolajen ile etkileşim gösterdiği ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır. Proteinin BJ fibroblast hücrelerine dair herhangi bir sitotoksik etkisinin olmadığı Wst-1 yöntemi ile belirlenmiştir. MrkD proteini K. pneumoniae'nin Bj hücrelerine bağlanma potansiyelini yaklaşık 0,85 log azaltmıştır. Sonuç: Bu çalışma kapsamında, BJ insan fibroblast hücreleriyle MrkD proteini arasında gerçekleşen etkileşim ilk kez deneysel olarak ortaya konmuş ve protein yapısının sitotoksik potansiyeli doğrudan analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçların, MrkD proteininin kolajenle ilişkisini açıklığa kavuşturması ve tedavi hedefi olabilecek yapılar için yol gösterici olması beklenmektedir.
Cloning and expression of potential vaccine candidates for Plasmodium falciparum
Introduction: Malaria remains a major global health burden, with Plasmodium falciparum responsible for the most severe and deadly cases. Despite current vaccine efforts, a fully protective and multistage vaccine remains elusive. This study focused on the cloning, expression, and evaluation of P. falciparum antigens as potential vaccine candidates targeting various life cycle stages of the parasite. Materials and Methods: Seven target genes encoding stage-specific antigens for circumsporozoite protein (CSP), thrombospondin-related ahesion protein (TRAP), apical membrane antigen (AMA-1), merozoite surface protein (MSP-1), falcipain (FAL), gametocyte surface protein (GSP) and transmission-blocking antigen (TBA) were synthetically constructed and codon-optimized for optimal expression in Escherichia coli. Signal peptide regions were removed to enhance expression efficiency and solubility. Four of the proteins namely AMA-1, MSP-1, FAL, and TBA were successfully expressed and purified. Cytotoxicity of the recombinant proteins was assessed using BJ human fibroblast cells treated with concentrations ranging from 1 to 200 μg/mL. Immunogenicity was evaluated in CD1 male mice assigned to groups of three, with each group receiving a mixture of adjuvant and a single or combination of the recombinant antigens, intramuscularly. The control group received an equivalent volume of adjuvant diluted in phosphate-buffered saline (PBS). The immunogenicity was then evaluated by indirect ELISA to measure antigen-specific antibody responses. Results: All four recombinant proteins exhibited successful expression and purification. ELISA results revealed that all proteins induced high antigen-specific antibody responses in immunized mice. Most importantly, the combination of antigens elicited higher antibody titers compared to individual antigen administration, suggesting a potential synergistic effect. Cytotoxicity assays showed low toxicity for the tested proteins, with BJ cell viability remaining above 70% even at the highest concentration tested, indicating biocompatibility. Conclusion: Malaria continues to pose a significant public health challenge in sub-Saharan Africa, where it accounts for most global cases and deaths, especially among children and pregnant women. The endorsement of two license malaria vaccines, RTS, S/AS01 and R21 represents a major milestone, however, both vaccines face limitations with modest efficacy. This study demonstrates the successful cloning, expression, and initial evaluation of four P. falciparum vaccine candidate proteins. Their low cytotoxicity and high immunogenic potential support their further development as components of a multistage malaria subunit vaccine. The promising findings of this study provide a foundational step toward developing a more effective, multistage malaria vaccine, which could play a critical role in reducing the disease burden and supporting elimination efforts in the most affected regions.
Rekombinant faj tail proteinlerinin bakterilere adezyonundaki rollerinin araştırılması
Amaç: Proteus mirabilis ve Proteus vulgaris, özellikle kateter ilişkili üriner sistem enfeksiyonları (CAUTI), piyelonefrit, sepsis ve taş oluşumu gibi ciddi klinik tablolarda rol alan önemli fırsatçı patojenlerdir. Bu bakterilerin sahip olduğu yüzey yapıları, biyofilm oluşturma kapasitesi ve artan antibiyotik direnci, enfeksiyonların tanı ve tedavisini güçleştirmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı, P. mirabilis RP6 ve P. vulgaris RP7 bakteriyofajlarından elde edilen reseptör bağlayıcı proteinler (RBP), Gp35 ve Gp106'nın rekombinant üretimi ve tanısal potansiyellerinin detaylı olarak değerlendirilmesidir. Çalışma, bu proteinlerin özgüllük, duyarlılık, bağlanma spektrumu, biyolojik örneklerdeki performansı, faj adsorpsiyonunu engelleme kapasitesi ve antibakteriyel/sitotoksik etkileri bakımından karakterize edilmesini hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Gp35 ve Gp106 proteinlerini kodlayan gen dizileri, spesifik primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiş ve elde edilen amplikonlar pET-30a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlama işlemi doğrulandıktan sonra, rekombinant proteinler Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilmiş ve Ni-NTA afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan RBP'lerin Proteus spp.'ye özgü bağlanma kapasiteleri kristal viyole boyama ve ELISA yöntemleriyle analiz edilmiştir. Farklı bakteri yoğunluklarıyla gerçekleştirilen C-ELISA deneyleri ile RBP'lerin tespit limitleri belirlenmiş, bağlanma spektrumları ise 49 klinik izolat ile test edilmiştir. Ayrıca, idrar gibi biyolojik ortamlarda bağlanma performansı test edilmiş ve rekombinant proteinlerin fajlar ile aynı reseptör bölgelerine bağlanıp bağlanmadığı rekabetçi adsopsiyon deneyleri ile ortaya konmuştur. Rekombinant proteinlerin antibakteriyel etkisi spot-test analizi ile, sitotoksisite ise insan fibroblast hücrelerinde WST-1 yöntemiyle belirlenmiştir. Bulgular: Gp35 ve Gp106 proteinleri yalnızca Proteus spp. izolatlarına bağlanmış, heterolog bakterilere (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) karşı sinyal üretmemiştir. C-ELISA tabanlı duyarlılık analizlerinde her iki protein de ≈10³ CFU/mL sınırında hedefe özgül bağlanma gösterebilmiştir. Bağlanma spektrumu analizinde Gp35'in Proteus izolatlarının %82,5'ine, Gp106'nın ise %90'ına bağlandığı saptanmış; bu durum Gp106'nın daha geniş bir konak aralığına sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bazı izolatlarda Gp35 ve Gp106 bağlanmasına rağmen ilgili fajların enfekte edememesi, RBP'lerin tanı platformlarında fajlara göre daha geniş spektrum sunabileceğini ortaya konmuştur. Biyolojik örneklerde yapılan testlerde RBP'ler, idrar ortamında özgüllüklerini koruyarak hedef bakterilere başarıyla bağlanmıştır. Rekabetçi faj adsorpsiyon testlerinde ise Gp35 ve Gp106'nın, RP6 ve RP7 fajlarının hedef hücrelere bağlanmasını %65–80 oranında engellediği belirlenmiştir. Bu sonuç, her iki proteinin de fajların bağlandığı özgül reseptörlere yöneldiğini ve bu reseptörleri işgal ederek faj enfeksiyonunu baskılayabildiğini göstermiştir. Son olarak, her iki RBP'nin de uygulandığı bakterilerde herhangi bir antibakteriyel etki gözlemlenmemiş, dolayısıyla yalnızca hedef tanıma ve bağlanma işlevi gördükleri belirlenmiştir. Ayrıca, bu iki rekombinant proteinin insan fibroblast (BJ) hücre hattı üzerinde de herhangi bir sitotoksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Sonuç: Bu tez çalışması, Proteus spp.'ye özgül rekombinant RBP'lerin ilk sistematik karakterizasyonunu sunmaktadır. Gp35 ve Gp106, tanı uygulamalarında kullanılmak üzere yüksek özgüllük, geniş spektrum, klinik örnek uyumluluğu ve hedef reseptör doğruluğu gibi özellikleri bir arada taşıyan adaylardır. Antibakteriyel veya sitotoksik etkiler göstermemeleri sayesinde, canlı hücre tespiti gereken uygulamalarda güvenle kullanılabilirler Literatürde benzer örnekleri bulunan RBP-temelli tanı sistemleriyle karşılaştırıldığında, bu çalışma, Proteus spp. enfeksiyonlarının hızlı, duyarlı ve özgül teşhisinde kullanılabilecek biyo-tanıma platformları için önemli bir temel oluşturmaktadır. Ayrıca, bu reseptör bağlayıcı proteinler, yalnızca tanı amaçlı değil, aynı zamanda hedefe yönelik tedavi stratejilerinde, örneğin nanopartiküllere bağlanarak antimikrobiyal ajanların hedefe taşınmasında da kullanılabilecek biyolojik araçlar olarak öne çıkmaktadır.
Restoration of vancomycin sensitivity using antisense RNA and investigation of its efficacy in vancomycin-resistant Enterococci in infected mice
Purpose: This study aimed to restore susceptibility in vancomycin-resistant Enterococcus strains using plasmid-encoded antisense RNA (asRNA) of the vanA/vanB genes, and to examine their in vivo efficacy in an experimental mouse model. Materials and Methods: The vanA and vanB genes were amplified by PCR from clinical E. faecium VRE50 and E. faecalis V583, respectively, then reverse cloned into pUC19 plasmid to generate antisense RNAs via restriction enzyme sites. These constructed plasmids with reversly oriented genes were transformed into E. coli DH10B. Then, asRNAs, for vanA and vanB were extracted and their abilities to restore vancomycin susceptibility were tested in vitro in the presence of vancomycin. The vancomycin MIC was done with or without asRNA and during 24-hour OD595 measurements were taken over 24 hours to generate growth curves. For in vivo analysis, liposome encapsulated and free asRNAs were administered intraperitoneally to VRE-infected CD-1 mice with vancomycin, and treatment outcomes were assessed by measuring CFU to calculate bacterial loads in peritoneal fluid. Additionally, murine sepsis scores of the mice were recorded and determined daily. Results: Acording to in vitro studies, while antibiotic susceptibility tests showed a remarkable reduction in vancomycin MIC values, decreasing from >256 µg/mL in the wild-type strain to 32 µg/mL in expressing vanA-antisense RNA by fusion plasmid in clinical VRE50, vanB-asRNA reduced in vancomycin MIC value from 64 µg/mL (MIC value of E.faecalis V583) to 16 µg/mL. Growth kinetics analyses revealed extended lag phases and reduced growth rates in antisense-expressing VRE strains, supporting the functional repression of resistance gene expression. In the murine sepsis model, mice treated with the combination of intraperitoneal antisense RNA and vancomycin exhibited significantly lower bacterial burdens in peritoneal fluid and improved clinical scores compared to control groups. While liposomal formulations were tested for in vivo delivery, their therapeutic efficacy appeared limited, possibly due to insufficient uptake or delayed release. Collectively, these results indicate that antisense RNA constructs can effectively impair van gene function both in vitro and in vivo, restoring antibiotic susceptibility and attenuating infection severity. Conclusion: This study demonstrates that plasmid-derived antisense RNAs targeting the vanA and vanB genes can effectively resensitize vancomycin-resistant Enterococcus strains both in vitro and in vivo. As a reversible and highly specific gene-silencing approach that does not require genome editing, antisense RNA technology emerges as a promising new strategy in the fight against antimicrobial resistance. Beyond its application to VRE, this method holds potential for targeting resistance genes in a wide range of multidrug-resistant pathogens.
Tis2/Go nanokompozit temelli nanosensörler ile parathion tayini
Amaç: Parathion pestisitini TiS2/GO Nanokompozit Temelli Nanosensörler Tayin etmek amacı ile yapıldı. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada, TiS₂/GO nanokompozit modifiye elektrot kullanılarak elektrokimyasal yöntemle parathion tayini gerçekleştirilmiş ve optimizasyon, karakterizasyon ile analitik performans değerlendirilmiştir. Bulgular: Sentezlenen TiS₂/GO kaplı biyosensörlerin SEM ve EDX analizleriyle morfolojik karakterizasyonu yapılmış ve elektrokimyasal davranışları DPV ve EIS ölçümleriyle incelenmiştir. Yaygın olarak kullanılan Parathion pestisitinin tayini için SPE elektrotları TiS₂/GO + %5 Nafion™ karışımıyla modifiye edilmiş olup, optimum pH çalışmaları sonucunda en yüksek sinyalin pH 7.0'da (153.425 µA) ve kabul edilebilir tekrarlanabilirliğin (RSD %6.864) sağlandığı belirlenmiştir. Farklı derişimlerde (10⁻9 – 10⁻⁴ M) yapılan ölçümlerle konsantrasyon-akım ilişkisi grafiği oluşturulmuş, ayrıca 10⁻⁵ M Parathion ile yapılan tekrarlanabilirlik testlerinde düşük RSD (%1.46) değeriyle yüksek tekrarlanabilirlik gösterilmiştir Sonuç: Bu tez çalışmasında TiS2/GO nanokompoziti ile SPE perde baskılı elektrotlar kullanılarak Elektrokimyasal yöntemlerle Parathion tayini yapılmıştır. Bu sayede geleneksel analiz yöntemlerine ek olabilecek elektrokimyasal yöntem geliştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Amperometri, Grafen oksit, Nano-kompozit, Parathion, Pestisit, TiS2, Sensör
Nanotel modifiye nanosensörler ile Chlorpyrifos tayini
Amaç: Bu araştırma, organofosforlu insektisitler grubunda yer alan Chlorpyrifos pestisit etkeninin, Au/PANI/Pt nanotel temelli nanosensörler kullanılarak elektrokimyasal olarak tespit edilebilirliğinin incelenmesi amacıyla yapıldı. Gereç ve Yöntem: Chlorpyrifos tayini için sırasıyla Au/PANI/Pt nanotelleri sentezlenmiş, karakterizasyonları yapılmış ve SPE elektrotların modifikasyonunda kullanılmıştır. Hazırlanan nanosensörün analitik performansı incelenmiş ve arazide kullanılabilirliği denenmiştir. Bulgular: Yapılan çalışmalarda optimum pH değeri 7.0 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca Differential Pulse Voltametry yöntemiyle yürütülen denemelerde en iyi Chlorpyrifos derişiminin 1x10-5 olduğu gözlemlenmiştir. Tekrar edilebilirlik sonuçlarına göre hazırlanan Au/PANI/Pt nanotel temelli nanosensörün Chlorpyrifos tayininde kullanılabilir olduğu belirlenmiştir. Sonuç: Au/PANI/Pt nanotel modifiye nanosensörlerin Chlorpyrifos pestisit etken maddesinin analizinde başarılı sonuçlar verdiği görülmüştür. Elde edilen bulgular, gıda güvenliği ve çevresel izleme uygulamalarında yeni nesil analitik metotların tasarımı için yol gösterici niteliktedir. Anahtar kelimeler: Pestisit, Nanotel, Chlorpyrifos, Elektrokimya, Nanosensör