Romatoid artrit oluşum mekanizmasında yer alan PAD4 enzimini inhibe eden rekombinant peptidlerin geliştirilmesi

Amaç: Romatoid artrit patogenezinden sorumlu peptidil arjinin deiminaz 4 enziminin aktivitesini azaltmaya yönelik değişken ağır zincir (VH; variable heavy chain) yapıda rekombinant inhibitor geliştirmektir. Gereç ve Yöntem: PAD4 geninin E. coli'ye göre kodon optimizasyonu yapıldı ve sentezlettirildi. Sentezlenen PAD4 geni pET-30a vektörüne klonlandı ve E. coli BL21 (DE3)'e aktarıldı, PAD4 proteininin rekombinant üretimi gerçekleştirildi ve IMAC ile saflaştırıldı. Saflaştırılan PAD4 ile CD-1 fareler immunize edildi. İmmünize fare dalakları alındı ve total RNA izolasyonu yapıldı. Ardından, cDNA sentezi ve VH amplifikasyonu gerçekleştirildi. VH amplikonları çalışmada konstrüksiyonu gerçekleştirilen pComb3-hy vektörüne klonlandı ve E. coli XL1-Blue'ya aktarılarak VH kütüphanesi oluşturuldu. VH kütüphanesini içeren bakteri kültürü M13K07 fajı ile enfekte edildi ve VH gösteren faj kütüphanesi elde edildi. VH kütüphanesinden PAD4'e afinite gösteren VH gösteren fajlar panning ile seçildi. Afinite gösteren VH'ın sekans analizi yapıldı. Elde edilen VH4'ün amino asit sekansı kullanılarak üç boyutlu yapısı belirlendi ve PAD4 ile etkileşimini araştırmak için Alphafold ile modelleme yapıldı. VH4'ün PAD4'ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonu floresans tabanlı izleme ile in-vitro olarak test edildi. VH4'ün PAD4'ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonunun HeLa memeli hücre hattına morfolojik etkisi üzerinden değerlendirildi. VH4'ün sitotoksisite deneyi HeLa hücreleri ile WST-1 kullanılarak yapıldı. Bulgular: Çalışmada, koloni PCR ve sekans analizi sonucunda PAD4'ün klonlandığı doğrulandı. SDS-PAGE analizinde 75 kDa civarı bant eldesi neticesinde rekombinant PAD4 üretimi ve saflaştırılması doğrulandı. PAD4'e karşı oluşturulan VH gösterimi yapan faj kütüphanesinden PAD4'e afinite gösteren bir fajın kodladığı VH sekansı belirlendi. VH4 adı verilen bu peptidin moleküler ağırlığının 13 kDa ve in-silico olarak PAD4 ile 6 tane hidrojen bağı oluşturduğu gösterildi. In-vitro deneylerde VH4'ün PAD4 aktivitesini %30 azalttığı ve memeli hücre hattıyla yapılan in-vitro deneylerde PAD4 kaynaklı morfolojik bozukluğu önlediği ve sitotoksik etkiye sebep olmadığı gösterildi. Sonuç: Bu çalışmada sitrülinleme aktivitesi ile romatoid artritin patogenezinde önemli bir role sahip olan PAD4 enzimine karşı VH yapıda rekombinant inhibitor geliştirildi. Bu inhibitörün amino asit sekansı, üç boyutlu yapısı ve PAD4 ile etkileşimi gösterildi. Rekombinant PAD4 inhibitörü VH4'ün romatoid artrit tedavisinde kullanılma potansilyelinin belirlenmesi için hayvan modellerinde etkinliğinin test edilmesi dahil ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar Kelimeler: romatoid artrit, peptidil arjinin deiminaz (PAD), faj gösterim tekniği, rekombinant peptid