+4 °C ve +38 °C taşıma ve depolama sıcaklıklarında köpek oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasına BSA ve FCS'nin etkileri

Bu çalışma iki temel bölümden oluşmaktadır. İlk bölümde ovariohisterektomi yöntemiyle elde edilen köpek ovaryumlarının +4 °C ve +38,5 °C taşıma sıcaklığında transportunun maturasyona üzerine etkilerinin neler olduğu hedeflenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise köpek oositlerinin in vitro olgunlaştırılması için medyumuna katılan %0,3 BSA ve % 5 FCS protein kaynaklarının etkilerinin karşılaştırılması amacıyla planlanmıştır. Ovario-histerektomi yapılmış köpeklerden alınan ovaryum çiftlerinden biri +4 °C'da diğeri +38,5 °C'da antibiyotik katkılı (Gentamisin Sülfat, 50 mg/ml) PBS solüsyonunu içeren iki farklı kab içersinde 2 saat süresinde laboratuvar ortamına getirilmiştir. Ovaryumlar çevresindeki fazla yağ ve dokudan arındırıldıktan sonra yıkanıp (+38 ºC) PBS içine konuldu. Slicing yöntemiyle elde edilen oositler yıkama petrilerine aktarıldı. In vitro olgunlaştırma için ayrılacak oositlerin seçiminde sağlam bir zona pellusida, en az 3-4 sıra kumulus hücresi, homojen ve zona içini dolduran koyu renkli vitellüs varlığı kriterleri göz önünde bulunarak oosit seçimleri yapıldı. Her iki ısı derecesi içinde üçerli çalışma grupları en az iki saat öncesinden hazırlanmış, üzeri mineral yağ (Sigma) ile örtülmüş, antibiyotik katılmış (Gentamisin Sülfat, 50 mg/ml) +38 °C ve %5 CO2 'liinkübatör ortamında bekletilmiş bulunan altı farklı olgunlaşma medyumuna (Hepes Modifikasyonlu TCM 199, Sigma M-2520) aktarılmıştır. +4 ºC Taşıma Sıcaklığı İçin; 1. Grup (Kontrol):TCM 199+2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol), 2. Grup (BSA):TCM199+% 0,3 BSA (Fraction V, Sigma A8806)+ 2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol), 3. Grup(FCS):TCM199+%5 FCS (Fetal Calf Serum Biochrom S 0115)+ 2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol) +38,5 ºC Taşıma Sıcaklığı İçin; 4. Grup (Kontrol):TCM 199+2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol), 5. Grup (BSA):TCM199+% 0,3 BSA (Fraction V ,Sigma A8806)+ 2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol), 6. Grup (FCS):TCM199+%5 FCS (Fetal Calf Serum Biochrom S 0115)+ 2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol) Daha sonra oositler Germinal Vezikül (GV) aşamasından MII aşamasına gelebilmesi için % 5 CO2 ve % 100'e yakın nemin sağlandığı +38,5 ºC'lık inkübatör ortamında 72 saat olgunlaştırıldı. Olgunlaşma süresinin sonunda oositlerin kumulüs hücreleri vorteks kullanılarak mekanik olarak uzaklaştırıldı. Ardından % 0,7 lik KCl solüsyonunda 4-5 dakika bekletildikten sonra lam-lamel arasında sıkıştırılarak sabitlendi. Hoechst 33258 solüsyonu ile boyandı. Oositlerin değerlendirilmesinde Ki Kare testi kullanıldı. P<0,05 düzeyinin istatistiksel fark bakımından önemli olduğu kabul edildi. Gruplar arasında bir tek (M II) aşamasını tamamlamış olanların istatiksel karşılaştırılmasında; +4 °C'da ki BSA grubu diğer kontrol gruplarından +4 °C ve +38 °C daki FCS gruplarından daha üstün olduğu belirlenmiştir (p<0,05). Sonuç olarak, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar doğrultusunda, köpek oositlerinin in vitro olgunlaşma çalışmalarında medyum proteininin katılmasının gerekli olduğu; olgunlaşmayı destekleyici olarak protein kaynağı olarak % 0,3 BSA 'nın, % 5 FCS' a göre ve +4 °C 'deki taşıma sıcaklığının + 38,5 °C 'da kinden daha etkili olduğu söylenebilir. Anahtar Kelimeler: Dişi köpek, Oosit, In vitro Olgunlaşma, BSA, FCS, Taşıma sıcaklıkları