Affinite ajanlarının aspergillus oryzae'de üretim platformunun oluşturulması

Biyoteknolojik uygulama alanlarında afinite ajanı olarak kullanılan monoklonal antikorlar(mAbs)'ın yüksek verimde heterolog olarak ifadelenmeleri; fonksiyonellik için üç boyutlu katlanma ve çözünürlük özelliklerinde karşılaşılan problemler ve/veya maliyetli üretim yöntemlerine ihtiyaç duyulması nedeniyle sınırlanmaktadır. Tek domainli ağır zincir antikorlar(VHH) ise, mAbs'e kıyasla önemli üstünlüklere sahip ve yalnızca tek bir ağır zincirden oluşması sebebiyle daha küçük boyuttaki, eşsiz antikor parçalarıdır. VHH'ler küçük boyutu, düşük immünojenikliği ve yüksek çözünürlüğü ile dikkat çekici afinite ajanları olarak, tanı, tedavi ve görüntüleme teknikleri dahil olmak üzere pek çok biyoteknolojik uygulamada mAbs'nin yerlerini almaya başlamıştır. Aspergillus oryzae (A. oryzae), uzun yıllardır fermentasyon teknolojisinde ve biyoteknolojik ürünlerin endüstriyel ölçekte üretiminde tercih edilen ve Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından Genel Olarak Güvenli (GRAS) statüsü verilmiş olan ipliksi fungidir. Taksonomik olarak kendisine en yakın Aspergillus türleri ile kıyaslandığında, A. oryzae genomunda özellikle hidrolitik enzimleri kodlayan genler bakımından daha fazla gene sahiptir. Bu güçlü salgılama mekanizması A. oryzae'i afinite ajanlarının büyük ölçekte ve güvenilir olarak üretimi için ideal bir platform haline getirmektedir. Bu tez çalışmasında, pyrG geni bakımından oksotrof haline getirilen A. oryzae'nin konak mikroorganizma olarak kullanıldığı biyoteknolojik bir platformun inşa edilmesi ve inşa edilen bu ifadelenme platformunun afinite ajanlarının üretiminde kullanılabileceğinin kanıtlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla afinite ajanı olarak seçilen ribonükleik asit A (RNaz A)'ya karşı spesifik olan anti-RNaz A VHH proteininin, küçük ölçekte ve fermentör düzeyinde üretilerek saflaştırılmasının gerçekleştirilmesi istenmiştir. A. oryzae'de, fonksiyonel ve yüksek verimde ürün alabilmek, ayrıca saflaştırma aşamalarında uygulanabilir kullanışlı metodolojilerin izlenebilmesi için, ifadelenmeyi sağlayacak olan gen kasedinin dizaynı ve oluşturulması önem arz etmektedir. Bunun için, pyrG oksotrofisinin homolog rekombinasyon yoluyla sağlanmasında, pyrG genini kodlayan açık okuma dizisinin bitişiğindeki dizileri barındıran ve doğrusal hale getirilmiş delesyon vektörünün, yabani tip A. oryzae suşuna aktarılması gerekmektedir. Bu tez çalışmasında, yabani tip A. oryzae RIB40 konak mikroorganizması, pyrG geni olmaksızın, pyrG geninin açık okuma çerçevesinin yukarı ve aşağı bölgelerinden oluşturulan delesyon vektörü ile transforme edilmiştir. Böylece homolog rekombinasyon yoluyla pyrG geninin yabani tip A. oryzae genomundan silinmesi sağlanmıştır. Gen delesyonunun seçici kültür koşullarında, tekrarlı kültürleme ve qPZR analizi yöntemleri ile doğrulaması gerçekleştirilmiştir. Doğrulanan pyrG oksotrof A. oryzae mikroorganizması rekombinant anti-RNaz A VHH proteininin ifadelenmesi çalışmalarında kullanılmıştır. Anti-RNaz A VHH proteinini kodlayıcı dizi, C-terminaline bağlı 8xHis-tag ile amilaz sinyal sekansı kullanılarak, amilaz promotörü altında olacak şekilde, A. oryzae'e göre kodon optimize olarak sentezlettirilmiştir. Transformasyon çalışmaları protoplast aracılı transformasyon yöntemi ile sağlandıktan ve rekombinant anti-RNaz A VHH proteinini ifadeleyen koloninin doğrulanması çalışmaları yapıldıktan sonra, küçük ölçekte ifadelenme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Küçük ölçekte ifadelenmenin başarı ile gerçekleştirilmesini takiben, 6 L'lik fermentörde büyük ölçekte üretim çalışmaları hayata geçirilmiştir. İfadelenen rekombinant anti-RNaz A VHH proteini, C-terminalindeki 8xHis-tag'den yararlanılarak immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) yöntemiyle saflaştırılmıştır. Buna göre; küçük ölçekte ifadelenmeden elde edilen verim 44 mg/mL olarak tespit edilirken, fermentörde yapılan ifadelenmeden elde edilen verim 1.4 g/L olarak belirlenmiştir. İleri saflaştırma işlemleri jel filtrasyon kromatografisi ile sağlanmış ve ifadelenen rekombinant anti-RNaz A VHH proteininin monomerik özellikte olduğu bu yöntem ile kanıtlanmıştır. Toplam üretilen protein ve ifadelenen rekombinant protein konsantrasyonu dansitometrik olarak analiz edilmiş ve bovin serum albümin(BSA)'inin standart olarak kullanıldığı Bradford tekniğiyle belirlenmiştir. Anti-RNaz A VHH'in, hedef antijeni olan RNaz A ile spesifik etkileşiminin belirlenmesinde; pull-down analizi, jel filtrasyon kromatografi analizi ve yüzey plazmon rezonans (SPR) analizi gerçekleştirilmiştir. Pull-down analizi spesifik etkileşimin varlığını gösterirken, jel filtrasyon kromatografi analizi ifadelenen anti-RNaz A VHH'in hedef antijeni ile bağlanabilen doğru üç boyutlu katlanma yapısında olduğunu kanıtlamıştır. SPR analizinde ise hedef antijen ile bağlanma afinitesi 1.9 nM olarak ölçülmüştür. Ölçülen bağlanma afinitesi, Escherichia coli (E. coli)'de üretilen anti-RNaz A VHH'in bağlanma afinitesinden yaklaşık 18.3 kat daha fazladır. Elde edilen veriler, kurulan pyrG oksotrof A. oryzae platformunda, anti-RNaz A VHH afinite ajanının büyük ölçekte ve yüksek bağlanma afinitesi ile doğru üç boyutlu formda ve monomerik olarak üretilerek, başarılı bir şekilde saflaştırıldığını ortaya koymaktadır. Buradan hareketle tez kapsamında varılan sonuçlar; çeşitli biyoteknolojik uygulama ve araştırma çalışmalarında ihtiyaç duyulan yüksek hacimde ve hedef antijenine yüksek bağlanma afinitesi gösteren VHH afinite ajanlarının, düşük maliyetle ifadelenmesinde, tez kapsamında inşa edilen pyrG oksotrof A. oryzae ifadelenme sisteminin, güçlü salgılama yeteneği sayesinde ideal bir platform olduğunu kanıtlar niteliktedir.