Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakteriasyonu

Karbohidrat esteraz 4 ailesi kitin, asetil ksilan ve peptidoglikan gibi polimerik substratları deasetile ederler. Son zamanlarda bu enzimlerden bazıları enzimolojik olarak karakterize edilmiştir. Termofilik bakterilerden ise bu aileye ait enzimlerle yapılmış sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu ailenin tüm üyeleri NodB'ye homolog domain adı verilen ortak korunmuş bir domain içermeleri ile karakterize edilirler.Termofilik Anoxybacillus flavithermus WK1 bakterisi genom projesi 2008 yılında tamamlanmıştır. Tüm genom karbonhidrat deasetilaz aday genleri için tarandığında iki adet gen belirlenmiştir. Bunlardan bir tanesi 762 baz çifti uzunluğuna sahiptir ve 253 amino asitlik bir protein kodlamaktadır. Bu gen, standart PZR primerleri ile çoğaltılarak histidin kuyruk içerecek şekilde pET-15b ekspresyon vektörünün NdeI bölgesine klonlandı. Rekombinant plazmit E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS ekspresyon hücrelerine transforme edilerek ekspres edildi. Rekombinant protein Ni-afinite kromotografisi kullanılarak saflaştırıldı ve saflığı Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile belirlendi. Enzim aktivitesi için substrat olarak ?-naftil asetat kullanıldı ve aktivite SDS-PAGE'de Fast Red boyaması ile gösterildi. AfCDA proteininin biyokimyasal özellikleri spektrofotometrik yöntemle kromojenik substrat olarak p-nitrofenil asetat kullanılarak belirlendi. Optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 50 °C ve optimum pH değeri 7,5 olarak belirlendi. Kinetik karakterizasyon çalışmalar substrat olarak p-nitrofenil asetat kullanılarak araştırıldı ve Km değeri 4,33 µM, Vmaks değeri ise 3333,33 U/mg olarak hesaplandı.Anoxybacillus flavithermus WK1 geninin nükleotid ve aminoasit dizilimi kullanılarak diğer türlerle olan akrabalık dereceleri incelendi. Filogenetik dendogramda A. flavithermus WK1 bakterisinin diğer Bacillus türlerinden açıkça ayrıldığı gözlendi. afcda geni aminoasit sırası, CE-4 ailesinin bilinen üyelerinin aminoasit sıraları karşılaştırılarak ClustalW programı ile korunmuş motifleri bulmak için kullanıldı. Toplam beş motiften dördünün korunmuş olduğu ve motif 2'nin ise tamamen farklı olduğu belirlendi.Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA enziminin her hangi bir metal iyonuna bağımlı olmadan aktivite gösterdiği belirlendi.