Aşı geliştirilmesinde kullanılmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilen L. infantum antijenlerinin in vivo oluşturduğu immün yanıtın karşılaştırmalı olarak incelenmesi

Dünya'nın ve Türkiye'nin en önemli halk sağlığı problemlerinden birisi olan Leishmaniasis, Leishmania türündeki zorunlu hücre içi parazitlerin neden olduğu tropikal bir hastalıktır. Dünyada 350 milyon kişi Leishmaniasis'e yakalanma riski altındadır. Hastalık Türkiye'nin de içinde olduğu 98 ülkede endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Hastalığın farklı klinik formlarından Visseral Leishmaniasis (VL), tedavi edilmediği durumlarda ölümlere neden olmaktadır. Hastalığın yaygın olarak görülmesinin nedenlerinin başında Leishmaniasis'e karşı henüz tam olarak etkin ve güvenilir bir aşı formülasyonunun geliştirilememiş olması gelmektedir. Günümüze kadar üç jenerasyonda aşı adayları geliştirilse de, her birinin farklı dezavantajları bulunmaktadır. Leishmaniasis'e karşı mevcut aşı çalışmaları rekombinant antijenlerin kullanımına dayalı olsa da tüm parazit antijeni kullanımına yönelik çalışmalar maliyet, güvenlik, antijenik özellik ve antijenin biyokimyasal bileşiminin stabilitesi açısından hala gündemdedir. Dondurup/ çözme yöntemiyle elde edilmiş çözünür tüm leishmania antijenlerinin (D/Ç Ag ve ya SLA) hastalığa karşı koruyucu çeşitli epitopları içermesi ve farklı MHC molekülleriyle etkileşime girebilmeleri aşı geliştirilmesinde önemli bir rol oynayabilir. Ancak bu tür aşı formülasyonlarının en büyük dezavantajı, elde edilen antijenlerin tek başına veya kullanılan çeşitli adjuvanlarla birlikte yeterli immün yanıt oluşturamamasıdır. Buna göre günümüzde öldürülmüş parazit antijenlerinin oluşturduğu immün yanıtı arttırabilmek için daha uygun adjuvanların araştırılması oldukça önemlidir. FDA onaylı ve suda çözünebilir bir polimer olan polioksidonyum (PO) insanlarda hem akut hem de kronik enfeksiyonlarının tedavisinde etkili bir immünostimülan (bağışıklık uyarıcı) etkiye sahip, güvenli bir immüno-düzenleyici olarak kabul edilmektedir. Bu durum PO'nun diğer bulaşıcı hastalıklara karşı aşı geliştirilmesinde de kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Ancak literatürde PO'nun öldürülmüş Leishmania antijenleriyle kombinasyonlarının immünojenik özellikleriyle ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı, Visseral leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde dondurup/çözme ve otoklavlama yöntemleriyle elde edilen öldürülmüş Leishmania infantum antijenlerinin PO adjuvanı ile aşı formülasyonlarının oluşturulması ve elde edilen formülasyonların immünojenik etkinliğinin in vitro ve in vivo olarak ilk kez incelenmesidir. Bu amaç doğrultusunda, öncelikle dondurup çözme ve otoklavlama yöntemleriyle öldürülmüş Leishmania antijenleri elde edilmiş ve PO adjuvanı ile birlikte farklı konsantrasyonlardaki formülasyonları elde edilmiştir. Daha sonra elde edilen formülasyonların toksisitesi J774 makrofaj ve L929 fibroblast hücre kültüründe MTT yöntemi ile incelenmiştir. Bunu takiben toksik olmadığı belirlenen formülasyonların makrofaj hücre kültüründe Nitrik Oksit (NO) üretme potansiyeli ve enfekte makrofajlardaki parazitleri öldürme konusundaki etkinliği incelenmiştir. In vitro sonuçlara göre hem dondurup/çözme hem de otoklavlama yöntemleriyle elde edilen antijenler için PO adjuvanıyla oluşturdukları en uygun formülasyon seçilmiş ve bu formülasyonların etkinliği in vivo hayvan modellerinde incelenmiştir. Balb/C fareler üzerinde yapılan 4 immünizasyon işleminin her ikisinde bir farelerin kan serumları alınmış ve oluşan antikor miktarı ELISA yöntemiyle belirlenmiştir. Ayrıca immünizasyonların tamamlanmasının ardından sakrifiye edilen farelerden dalak lenfositleri izole edilmiş ve lenfositlerden salgılanan IL-4, IL-10, IL-12 ve TNF-α sitokinleri ticari bir kit yardımıyla tayin edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, incelenen farklı antijen konsantrasyonlarının J774 makrofaj ve L929 fare fibroblast hücre kültüründe kontrole kıyasla anlamlı bir toksik etki göstermediği saptandı. Formülasyonların, makrofajların NO üretmeleri üzerindeki etkinliği incelendiğinde ise, makrofaj hücrelerinde NO üretimine en fazla etkiyi kontrole kıyasla NO üretimini 4 kat arttıran PO-D/Ç Ag kombinasyonu (250 µg/ml:100 µg/ml) ve PO-Otoklavlanmış Ag kombinasyonunun (250 µg/ml:100 µg/ml) gösterdiği saptandı. Böylece yapılan in vitro çalışmalar sonucunda en uygun aşı formülasyonunun PO-D/Ç Ag kombinasyonu (250 µg/ml:100 µg/ml) ve PO-Otoklavlanmış Ag (250 µg/ml:100 µg/ml) kombinasyonu olduğu belirlendi. Daha sonra belirlenen bu formülasyonlar Balb/c fareler üzerinde denendi. Farelerden alınan serum örneklerinde hem PO-D/Ç Ag kombinasyonunun hem de PO-Otoklavlanmış Ag kombinasyonunun antikor seviyesininin tek başına antijen ve adjuvan uygulanmış gruplara göre anlamlı şekilde arttığı tespit edilmiştir. Ancak en yüksek antikor seviyesi, PO-D/Ç Ag kombinasyonunun uygulanan gruplarda gözlenmiştir. Ayrıca farelerin sakrifikasyonunun ardından elde edilen dalak lenfosit kültürlerinde PO-D/Ç Ag kombinasyonunun ve PO-Otoklavlanmış Ag kombinasyonunun IL-12 ve TNF-α sitokin seviyelerini anlamlı bir miktarda arttırdığı, diğer yandan IL-4 ve IL-10 seviyelerinde ise herhangi bir değişikliğin olmadığı belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, farklı yöntemlerle elde edilen öldürülmüş Leishmania antijenlerinin PO ile kombinasyonlarının farelerde gerek antikor seviyesini gerekse de TH1 immün yanıtı indükleyen IL-12 ve TNF-α sitokin seviyelerini arttırması, bu aşı formülasyonlarının immünojenik özelliklerini net bir şekilde ortaya koymuştur. Böylece bu çalışmada ilk kez olarak, farklı yöntemlerle elde edilen öldürülmüş parazit antijenlerinin PO ile hazırlanan formülasyonlarının, aşı adayı olarak önemli bir potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Öldürülmüş Leishmania antijenleri ve PO'dan oluşan formülasyonların gelecekte Leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde önemli bir rol oynayabileceği düşünülmektedir. Böylece bu tez çalışması kapsamında ilk kez olarak visseral leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinede PO'a dayalı tüm L. İnfantum antijenlerini içeren aşı adayı formülasyonları elde edilmiştir. Ayrıca leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinede ilk kez olarak makrofaj hücre sisteminin aşı adaylarının seçilmesinde uygun olduğu gösterilmiştir. Geliştirilmiş yeni aşı adaylarının ileride birinci jenerasyon aşı adayları arasında yer alabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: L.infantum, PO, MTT, hücre kültürü, nitrik oksit, aşı, sitokin