Asmada (Vitis vinifera L.) CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile küllemeye (Erysiphe necator) dayanıklı bitkilerin geliştirilmesi

Dünya çapında asma yetiştiriciliğinde ekonomik açıdan en büyük kayıplar Erysiphe necator'un neden olduğu külleme hastalığından kaynaklanmaktadır. Dünyada toplam üzüm üretiminin yaklaşık %90'ına karşılık gelen çeşitlerin oluşturduğu Vitis vinifera L. türüne ait asmaların yaklaşık tamamının bu hastalığa hassas olduğu kabul edilmektedir. Patojenin dünyadaki üzüm yetiştirme bölgelerine yayılmış olması, bağcılıkta sık ilaçlama programlarının kullanımını gerektirmektedir. Bu amaçla kullanılan kimyasallar, yetiştiriciler için ek üretim maliyeti olmakla birlikte bağda çalışanlar ve bağda bulunan faydalı organizmaların sağlığını da olumsuz etkilemektedir. Son yıllarda pek çok araştırma, S (susceptible) genleri olarak tanımlanan, bitki ve patojen arasındaki uyumlu etkileşime olanak sağlayan genlerin dirençli tür ıslahında kullanım potansiyeli bulundurduğunu göstermektedir. MLO adı verilen lokuslarda bulunan S-genlerinin susturulması ile bitkilere külleme direnci kazandırılabileceğine yönelik çeşitli araştırmalar bulunmaktadır. A. thaliana, arpa, domates gibi bitkilerde bu uygulamanın başarılı sonuçları, asmada MLO genleri ile gerçekleştirilecek gen susturma çalışmaları için umut olmuştur. Çalışmada, CRISPR teknolojisinin uygulama alanlarından; gen susturma ve baz düzenlemesi birlikte kullanılarak MLO ve ALS (asetolaktat sentaz) genlerinde mutasyonlar oluşturulması hedeflenmiştir. Bunun için Agrobacterium tumefaciens ve CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak, ilgili kılavuz RNA'lardan asmaya hem geçici hem de kalıcı olarak aktarılanların seçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda, MLO genlerini susturmaya yönelik hazırlanmış vektör tasarımının yanında ALS (asetolaktat sentaz) genlerini hedefleyen ek bir tasarım, bitkiye A. tumefaciens EHA105 suşu aracılığıyla entegre edilmiştir. Bunun için öncelikle ALS genlerine yönelik hazırlanan transformasyon vektörünün ilgili genlerde baz değişimi (C→U(T)) gerçekleştirmesi, Prolin (ALS1 geni için Pro 74, ALS2 geni için Pro175) amino asidinin Serin'e dönüştürülmesi hedeflenmiştir. Bu değişikliğin bitkilerde sülfonil üre grubu herbisitlere karşı dayanım geliştirdiği literatürde yer alan çok sayıda çalışma ile gösterilmiştir. Geçici transformasyon sonrası seçilen embriyojenik kalluslar sülfonil üre grubu herbisit seleksiyonundan geçirilerek bitki rejenerasyonları sağlanmıştır. Çalışma sonunda Siyah Kişmiş çeşidinde rejenere edilen 132 bitkinin 28'inde transformasyonun kalıcı olarak gerçekleştiği belirlenmiştir. Bunlar arasında 2 bitkide Gly177 rezidülerde tek baz mutasyonları izlenmiştir. Geçici entegrasyonun değerlendirildiği, kalan 104 bitkide mutasyon izlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçların, asmada Siyah Kişmiş çeşidinde izlenecek gen aktarma çalışmalarında etkin olarak kullanılabileceği, transgen taşımayan ve MLO genleri yönünden mutant bitkilerin elde edilmesi için ise gelecekte yapılacak çalışmalara yol göstereceği beklenmektedir.