Bazı bitkilerde pullulanaz aktivitesinin araştırılması, pullulanazın saflaştırılması ve immobilizasyonu

Bu çalışmada öncelikle, ülkemizde meyve ve sebze olarak yaygın tüketilen bitkilerde pullulanaz aktivitesi araştırıldı. Yapılan enzim aktivitesi tarama çalışması sonucunda enzim kaynağı olarak enginar yaprağının kullanılmasına karar verildi. Enginar yaprağından pullulanazın saflaştırılması ilk kez gerçekleştirildi ve enzimin kinetik özellikleri incelendi. Saflaştırılan enzim çeşitli taşıyıcılar üzerine adsorpsiyon yöntemi ile immobilize edildi. İmmobilize enzimin karakterizasyonu yapıldı. Sonuçlar serbest enzim ile karşılaştırıldı. Enginar yaprağı 100 mM sodyum fosfat tamponu (pH 6,5) ile homojenize edildi. Pullulanaz aktivitesi gösteren homojenat ultrafiltrasyon ve diyaliz işlemlerine tabi tutuldu. Elde edilen diyalizata DEAE-selüloz kolon kromatografisi uygulanarak pullulanaz 21,53 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi Miller?ın indirgen şeker yöntemine göre; protein miktar tayini ise Bradford ve Warburg-Christian yöntemlerine göre gerçekleştirildi. Maksimum enzim aktivitesinin elde edilebilmesi için uygun enzim ve substrat miktarı belirlendi. Enzimin molekül ağırlığı tayini ve saflık kontrolü amacıyla yapılan SDS-PAGE elektroforezinde enginar yaprağı pullulanazı tek aktivite bandı gösterdi ve molekül ağırlığı 141,37 kDa olarak saptandı. Saflaştırılan enzimin pullulan, dekstrin, amilopektin ve nişasta substratlarına karşı ilgisi incelendi. Pullulanazın ilgisinin en çok dekstrine olduğu ve bu substrat için optimum pH?nın 5, optimum sıcaklığın ise 45°C olduğu tayin edildi. Enzimin aynı substratlara karşı Km değerleri sırasıyla 5,1382X10-5 mg/mL, 5,9093X10-4 mg/mL, 2,0986X10-3 mg/mL ve 3,8726X10-3 mg/mL; Vmaks değerleri ise 0,8037 U/mL, 0,9848 U/mL, 0,8089 U/mL ve 0,7892 U/mL olarak bulundu. Depo kararlılığı ve termal kararlılık çalışmaları gerçekleştirildi. Enginar yaprağı pullulanazı aktivitesine organik ve anorganik bileşiklerin, organik çözücülerin, çeşitli asit ve bazların, deterjanların etkisi araştırıldı. Adsorpsiyon yöntemi ile enzimin kitosan boncuk, PEG-6000 kaplı kitosan boncuk ve amberlit XAD-16 üzerine immobilizasyonu gerçekleştirildi. İmmobilize pullulanazların optimum pH, sıcaklık, termal kararlılık, depo kararlılığı, tekrar kullanılabilirlik, çeşitli bileşiklerin immobilize enzim aktivitisine etkisi gibi özellikleri incelendi. Bulunan sonuçlar serbest enzim ile karşılaştırıldı.