Bazı bitkilerin fenolik madde ekstraksiyonunun Taguchi yöntemiyle optimizasyonu; antioksidan ve antibakteriyel kapasitelerinin incelenmesi

Deney tasarımı; bir veya daha fazla sayıda olan değişkenin sistem üzerindeki etkisini inceleyen analiz tekniğidir. Bu sayede bir sistem tasarlanırken, sisteme ait faktör ve yanıtları arasındaki ilişkiyi açıklamayı sağlar. Sistemi etkileyen faktörlerin artması klasik deney tasarımın uygulanmasını zorlaştırır. Bu gibi durumlarda daha fazla bilgi edinebilmek ve test sayısını azaltmayı hedefleyen Genichi Taguchi, kendi anıyla anılan yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Taguchi metodu ürün ya da sistemlerde kaliteyi arttırma ve maliyet düşürmeyi amaçlayan deney tasarım yöntemlerinden biridir. Bu tasarımda esas amaç; değişkenlerin azaltılmasıyla hedef değere en hızlı şekilde ulaşmaktır. Bu metot ayrıca tasarımı etkileyen faktörlerin birbirindenbağımsız olarak değerlendirebilmesini sağlamaktadır. Fenolik bileşikler, sekonder metabolit olarak da bilinen ve tüm bitkilerde bulunan doğal maddelerdir. Farklı nitelikte ve miktarda olan fenolik bileşikler bitkiler için karakteristiktir. Savunma mekanizması olarak bitkilerde görev alırlar. Bu bileşiklerin, koroner kalp, katarakt, diyabet vb. hastalık risklerini azaltan olumlu etkilerinin varlığı bilinmektedir. Bu sebeple tıp ve eczacılık alanlarında kullanılmaktadır. Fenolik bileşiklerin eldesinde ekstraksiyon teknikleri ve koşulları önemlidir. Çözgen tercihi, ekstraksiyon süre ve sıcaklığının kontrolü gibi etkenler fenolik madde kayıplarının azaltılması için optimum şekilde düzenlenmelidir. Hibiskus (Hibiscus sabdariffa L) bitkisi hem zengin içeriği hem de yoğun çanak yaprak renginden dolayı birçok ensüstriyel gıda ürününde kullanılmaktadır. Kerkede olarak da bilinen hibiskus bitkisi ile yapılan çalışmalarda antioksidan kapasitesinin yüksek olduğu, antibakteriyel özelliklere sahip, ateş düşürücü ve tansiyon düşürücü gibi etkileri olduğu gözlemlenmiştir. Aspir (Carthamus tinctorius), analjezik ve ateş düşürücü etkilerinin yanı sıra kumarinler, tanenler, polifenoller ve flavonoidler gibi farklı biyoaktif bileşiklerin potansiyel kaynağı olarak bilinmektedir. Hatmi çiçeği olarak bilinen Althaea officinalis iltihap, mide ülseri, öksürük, nezle gibi bazır hastalıkların tedavisinde kullanıldığı farmokolojik araştırmalarda rapor edilmiştir. Aynısefa (Calendula officinalis L.) bitkisi papatyagiller familyasında bulunan otsu bir bitkidir. Tahriş olmuş iltihaplı derilerde, egzamada, ülser tedavisinde uzun zamandır kullanıldığı bilinmektedir.Çay olarak tüketilebilen ve tıbbi amaç için kullanıldığı bilenen bu bitkiler fenolik madde elde etmek için kullanılacaktır. Ekstraksiyon işlemini etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Katı-sıvı oranı, katı-çözücü temas yüzeyi, sıcaklık, ekstraksiyon işlem süresi, çözücü çeşidi gibi faktörler ekstraksiyon işleminin kalitesini ve verimini etkileyebilir. Bu çalışmada ekstraksiyon işlemlerini etkileyen parametrelerin optimizasyonu için Taguchi deney tasarımı metodu kullanılmıştır. Taguchi modellemesi için ekstraksiyon işlemini etkileyen parametrelerden ekstraksiyon yöntemi, çözücü, sıcaklık ve süre olmak üzere 4 farklı faktör seçilmiştir. Bu faktörlere ait 3 seviye belirlenmiştir. Ekstraksiyon yöntemi için ultrasonik, klasik ve karıştırmalı yöntemler seçilmiştir. Ultrasonik ekstraksiyon için 45 kHz frekansta ısıtmalı bir ultrases banyosu kullanılmıştır. Klasik ekstraksiyon yöntemi olarak su banyosunda belirlenen sıcaklık ve sürede işlem gerçekleştirilmiştir. Karıştırılmalı ekstraksiyon yönteminde ise 300 rpm hızda dönen manyetik çubuktan yararlanılmıştır. Fenolik maddelerin tıp ve eczacılık gibi insan sağlığını ilgilendiren alanlarda kullanılmasından dolayı grass olarak kabul edilen çözücüler seçilmelidir. Bu sebeple etanol, metanol ve distile su ekstraksiyon işlemi sırasında çözücü olarak kullanılmak üzere seçilmiştir. Sıcaklık (25°C, 40°C, 55°C) ve süre (30 dk., 60 dk., 90 dk.) fenolik maddelerin artan sıcaklık ve ekstraksyion süresine bağlı termal bozunmaya uğradığı bilindiğinden yüksek sıcaklık ve uzun süreler tercih edilmemiştir. Seçilen 4 faktör ve faktörlere ait 3 seviye bulunmakatadır. Belirlenen faktör ve seviyeler için serbestlik derecesi 8'dir. Belirlenen faktörler ve serbestlik derecesi Minitab19 paket programı kullanılarak deney tasarımı L9 ortogonol dizi seçilerek modellenmiştir. Modelleme sonucunda programda belirlenmiş 9 farklı deney seti ve 3 tekrarlı olacak şekilde ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Toplam fenolik madde miktarı (TFM) analizi en çok tercih edilen yöntem olan Folin-Ciocalteau yöntemine göre analiz edilmiştir ve sonuçlar gallik asit cinsinden rapor edilmiştir. Hibiskus için en yüksek değer 24,8±1,01 mg GAE/g, Aspir için 3,08±0,21 mg GAE/g, hatmi çiçeği ve aynusefa için ise sırayla 3,50±0,05 mgGAE/g, 39,47±2,06 mgGAE/g olarak hesaplanmıştır. 9 deney seti için tüm TFM miktarı değerleri deney tasarımıda sistem çıktısı olarak programa yanıt şeklinde işlenir. Programda bu yanıtlara göre Taguchi analizinin gerçekleştirilmesiyle tüm faktör ve seviyelere ait sinyal gürültü oranları hesaplanmıştır. Bu oranlara ve ortalamaya ait etki grafikleri program çıktısı olarak elde edilmiştir. Bu hesaplamalar sonucunda hibiskus, hatmi çiçeği, aynısefa bitkisinin optimum parametreleri karıştırmalı ekstrasksiyon, distile su 55°C ve 60 dk. olarak bulunmuştur. Aspir bitkisinde ise farklı olarak bu sıcaklık 40°C olarak saptanmıştır. Modellemenin daha iyi anlaşılabilmesi ve yorum yapmayı kolaylaştırması amacıyla faktör ve parametrelerin fenolik madde miktarını etkileme yüzdeleri araştırılmıştır. Bu sebeple varyans analizi kullanılmıştır. Tüm bitkiler için etki yüzeyleri incelendiğinde çözücü faktörünün etkisi yüzdesel olarak diğer faktörlere göre daha yüksektir. Hibiskus, aspir, hatmi çieçği ve aynısefa bitkileri için çözücü faktörünün ekstraksiyon işlemine yüzdesel katkıları sırasıyla; %59,09, %81,82, %60,70 ve %58,50'dir. Varyans analizi aynı zamanda sonuçların belirlenen güven aralıklarında anlamlı olup olmadığını test etmektedir. Hibiskus ve aynısefa bitkisine ait tüm faktörlerin değişiminin ekstraksiyon işlemine katkısı anlamlı iken aspir ve hatmi çiçeği için sıcaklık ve süre faktörlerindeki değişim ekstraksiyon işlemi için anlamsız bulunmuştur (p<0.05). Modellemenin doğruluğunu araştırmak için optimum koşulları belirlenen bu bitkiler ile üç paralelli olacak şekilde ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiş ve programda beklenen değerler ile karşılaştırılmıştır. Aspir ve aynısefa bitkisi için sonuçlar %95 güven aralığında anlamsız bulunmuştur. Hibiskus ve hatmi çiçeği için ise sonuçlar anlamlıdır. Optimum parametreler ile gerçekleştirilen ekstraksiyon işlemi sonucunda antioksiadan aktivite kapasite tayini ve antibakteriyel kapasite tayini geçekleştirilmiştir. Antioksidan kapasite tayini, DPPH radikali yakalama yöntemine göre yapılmıştır. Hibiskus, aspir, hatmi çieçği ve aynısefa bitkileri % inhibisyon değerleri sırasıyla %60,03, %43,85, %53,98, %35,02 oalrak hesaplanmıştır. Sonuçlar BHT (bütillenmiş hidroksitoluen) antioksidan standardı ile karşılaştırılmıştır. Bitkilerin antibakteriyel özelliklerini incelemek için kuyucuk difüzyon yöntemi kullanılmıştır. Analiz aşamasında Escherichia coli (gram negatif), Bacillus cereus (gram pozitif) ve Staphylococcus aureus kullanılmıştır. Aynısefa bitkisi Bacillus cereus (SBT-8) suşu üzerinde en yüksek inhibisyon sağlayan bitkidir (Hibiskus;10 mm, aspir; 9 mm Hatmi; etki yok). Staphylococcus aureus (29213) bakterisi için ise hibiskus, aspir ve aynısefa bitkilerinin inhibisyon çapları sırasıyla; 12 mm, 9 mm, 10 mm olarak ölçülmüştür. Sonuçlar incelendiğinde hatmi çiçeğinin hiçbir bakteri suşu üzerinde inhibe edici etkisinin varlığı saptanmamıştır. Ayrıca E. coli, bakterisi üzerinde de bitkilere ait bir etki saptanmamıştır