İmmobilize Geobacillus stearothermophılus L-arabinoz izomeraz'ın karakterizasyonu

Düşük kalorili bir tatlandırıcı çeşidi olan D-tagatoz'un üretimi için Geobacillus stearothermophilus mikroorganizmasından elde edilen L-arabinoz izomeraz ile ilgili bir çalışma yapılmıştır. Endüstriyel olarak D-tagatoz, gelinen en son aşamada, ancak kimyasal yöntemlerle üretilebilmektedir. Fakat bu yolla da pek çok yan ürün ve atıklar meydana gelmektedir. Biyolojik yoldan D-tagatoz'un üretimi ticari açıdan henüz daha mümkün olabilmiş değildir. Yapılan bu çalışmada ilk olarak L-arabinoz izomeraz hücresel olarak E.Coli'ye iletilmiştir. Enzimin de sonrasında saflaştırılması ve izolasyonu yapılmıştır. Bu sayede de üç farklı L-arabinoz izomeraz fraksiyonu elde edilmiş olup, bunlar da sırasıyla; intrasellüler enzim, ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim şeklindedir. Bu çalışma, doğal Geobacillus stearothermophilus dan olan immobilize edilmiş üç farklı enzim fraksiyonunun sistematik bir yaklaşım dahilindeki karakterizasyonunda ve karşılaştırılmasında bir ilki teşkil etmektedir L-arabinoz izomeraz'ın aktivitesi, enzimin saflaştırılması ve izolasyonu sırasında açığa çıkartılmış olan üç farklı enzim fraksiyonu için ayrı ayrı hesaplanmıştır. L-AI aktivitesi intrasellüler enzim, ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim için sırasıyla 8.55 ± 0.13 U/ml, 7,95 ± 0.03 U/ml ve 6.75 ± 0.06 U/ml şeklindedir. Ardından, imobilizasyon işleminden önce olmak üzere, intrasellüler enzim ve ham ekstrakt, saflaştırılmış enzim ile aynı protein konsantrasyonuna getirilmek amacıyla seyreltilmişlerdir. Seyreltilmiş intrasellüler enzim, seyreltilmiş ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim, imobilizasyon işlemi öncesinde 60°C sıcaklıkta ve pH 7.0 de dönüşümsel bir deneye tabi tutulmuşlardır. 48 saat inkübe edildikten sonra D-tagatoz konsantrasyonu sırasıyla 67.2 ± 0.8 g/l, 61.3 ± 3.2 g/l ve 68.7 ± 2.2 g/l şeklinde bulunmuştur. Bu sayede tüm enzim fraksiyonları için D-tagatoza olan bu dönüşüm ispatlanmıştır. Sonrasında, üç tane olarak elde edilmiş bulunan birbirinden farklı enzim fraksiyonları aljinat boncukları içerisine hapsedilmiş ve bu sayede D-galaktoz'un D-tagatoza olan dönüşümü için gerekli olan optimum sıcaklık ve optimum pH değerleri tespit edilmiştir. Bu deneyler serisi 50°C ile 90°C arası sıcaklık değerlerinde ve pH 7.0 'de gerçekleştirilmiştir. Optimum pH hesaplanmasında da, pH 5.0 ile pH 9.0 arasındaki değerlerle çalışılmıştır. Bunun yanı sıra D-tagatoz konsantrasyonu sistein – karbazol metodu ile tayin edilmiştir. Üç tane farklı immobilize edilmiş olan enzim fraksiyonları, üçü de aynı olacak şekilde 80°C optimum sıcaklık değeri göstermişlerdir. 80°C ve pH 7.0 de gerçekleştirilen beş saatlik bir inkübasyon sonunda D-tagatoz konsantrasyonları 54.2 ± 0.5 g/l, 27.9 ± 1.2 g/l ve 36.1 ± 1.0 g/l olarak sırasıyla seyreltilmiş intrasellüler enzim, seyreltilmiş ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim için elde edilmiştir. Farklı boncuklar için de optimum pH 6.5 olacak şekilde bulunmuştur. 60°C ve pH 6.5 de gerçekleştirilen 5 saatlik inkübasyonun ardından da D-tagatoz konsantrasyonları 23.2 ± 0.3 g/l, 10.5 ± 0.3 g/l and 13.2 ± 0.3 g/l olarak sırasıyla seyreltilmiş intrasellüler enzim, seyreltilmiş ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim için hesaplanmıştır. Bu çalışmada ortaya çıkan sonuçlara göre, aljinat boncuklarına hapsedilmiş intrasellüler enzim, ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzimin hepsi, D-galaktoz'un D-tagatoz'a dönüşümü için aynı optimum şartlara sahiptirler. Her bir fraksiyon için ayrı olarak optimum sıcaklık ve pH değerleri 80°C ve 6.5 olarak sırasıyla elde edilmiştir. Bu bulgular, D-galaktoz'un D-tagatoz'a olan biyolojik dönüşümünde bilgi verici olacaktır. Ayrıca bu, D-tagatoz'un üretimi için, Geobacillus stearothermophilus dan immobilize L-AI ın verimliliğinin ve stabilitesinin geliştirilmesindeki büyük bir araştırmanın da ilk adımıdır.