CRISPR prime editing ile OPTN genindeki splice-site mutasyonuna yönelik in-vitro düzeltme yaklaşımının etkinlik ve verimlilik analizi

Amaç: Prime Editing (PE), CRISPR-Cas tabanlı genom düzenleme teknolojileri arasında, çift iplikli DNA kırığı oluşturmadan ve düşük hedef dışı yan etki ile yüksek özgüllükle hedef nükleotid değişikliklerine olanak sağlayan yeni nesil bir yaklaşımdır. Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), motor nöronların progresif kaybı ile seyreden, tedavi seçenekleri sınırlı, yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır. ALS tip 12 (ALS12), OPTN genindeki patojenik varyantlar ile ilişkilidir. Bu tez çalışmasında, OPTN geninde yer alan c.1242+1G>A splice-site varyantının, hastadan elde edilen primer fibroblast hücrelerinde PE2 yöntemi ile in vitro olarak düzeltilmesinin etkinlik ve verimliliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmada, OPTN:c.1242+1G>A varyantını hedefleyen özgün bir epegRNA tasarımı in silico olarak gerçekleştirilmiştir. EpegRNA dizileri Golden Gate klonlama yöntemi ile pU6-GG-acceptor vektörüne klonlanmış ve Cas9-nickaz–reverse transkriptaz içeren pCMV-PEmax plazmidi ile hastadan elde edilen primer fibroblast hücrelerine Lipofektamin aracılı transfeksiyon uygulanmıştır. Ayrıca kullanılan OPTN:c.1242+1G>A_eGFP-epegRNA ve pCMV-PE2-tagRFP-BleoR plazmitleri sayesinde transfeksiyon başarısı GFP ve RFP floresan markerlar ile doğrulanmıştır. Prime Editing sonrası genomik DNA izolasyonu yapılmış, hedef bölge amplifiye edilerek yeni nesil dizileme (NGS) ile analiz edilmiştir. Düzenleme verimliliği, yüksek derinlikli dizileme verilerinin Integrative Genomics Viewer (IGV) üzerinden sayısal olarak değerlendirilmesi ile hesaplanmıştır. Çalışma ilgili etik kurul onayı ve hastadan alınan bilgilendirilmiş onam doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Bulgular: NGS analizleri sonucunda, OPTN:c.1242+1 pozisyonunda hedeflenen A>G düzeltmesinin farklı transfeksiyon havuzlarında yaklaşık %0,07–%0,41 arasında değişen oranlarda gerçekleştiği saptanmıştır. Biyolojik duplikat uygulanan deney havuzlarında benzer düzenleme oranlarının elde edilmesi, sonuçların tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Artan plazmid dozları ile düzenleme verimliliği arasında pozitif bir ilişki gözlenmiştir. GFP ve RFP pozitif hücrelerin saptanması transfeksiyonun başarıyla gerçekleştirildiğini doğrulamıştır. Sonuç: Bu tez çalışması, literatürde ilk kez OPTN genindeki c.1242+1G>A splice-site varyantının, hastadan elde edilen primer fibroblast hücrelerinde Prime Editing yöntemi ile hedeflenebileceğini göstermektedir. Elde edilen düzenleme oranları düşük olmakla birlikte PE teknolojisinin ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda hastaya özgü hücrelerde uygulanabilirliğini ortaya koymaktadır. Bu düzeltme, OPTN geninin normal splice mekanizmasının yeniden sağlanması açısından potansiyel terapötik önem taşımaktadır. Bulgular Prime Editing verimliliğinin optimizasyon çalışmalarının artırılması ve ileri düzey hücresel seçim stratejileri ile klinik uygulamalara taşınabileceğine işaret etmektedir.