SARS-CoV-2'ye karşı ikinci jenerasyon multi-epitoplu homolog virüs benzeri parçacık (VLP)-temelli aşı adayının bitki platformunda geliştirilmesi

Ağır akut solunum yolu sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)'nin neden olduğu koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisinin ciddi etkisi, dünya çapında çok çeşitli aşıların kullanılmasıyla hafifletilmiştir. Bununla birlikte, COVID-19 aşılarının adil dağıtımı, özellikle gelişmekte olan ve az gelişmiş ülkelerde zor olmaya devam etmektedir. SARS-CoV-2'ye karşı COVID-19 aşılarının hem üretiminde hem de uygulanmasında bugüne kadar gösterilen büyük çabalara rağmen, ortaya çıkan varyantları çapraz nötralize edebilen erişilebilir bir aşı geliştirilmesi önemini korumaktadır. Bu sebeple bu tezde, SARS-CoV-2'nin tüm yapısal proteinlerini içererek SARS-CoV-2'nin yapısına en yüksek benzerlikle geniş bir antijenite yelpazesi sergileyebilecek ve böylece ortaya çıkan varyantlara karşı koruma sağlayabilecek virüs benzeri partikül (VLP) tabanlı bir aşı adayının uygun maliyetli ve hızlı bir ekspresyon sistemi olan bitki platformunda üretilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, SARS-CoV-2'nin yapısal proteinlerini [spike (S), membran (M), nükleokapsid (N) ve zarf (E)] kodlayan genler için ekspresyon kasetleri tasarlanmıştır. Hücresel kompartmanlaşmanın (endoplazmik retikulum; ER ve kloroplast; chl) ifade ürünlerinin seviyesi üzerindeki etkisini araştırmak için farklı sinyal dizileri eklenmiştir. Kodon optimizasyonunu takiben, gen kasetleri ticari olarak sentezlenmiştir. Gen kasetleri, bir bitki ekspresyon vektörü olan pEAQ-HT'ye ayrı ayrı başarıyla klonlanmıştır. İlgilenilen geni (GOI) taşıyan her plazmid elektroporasyon yoluyla Agrobacterium tumefaciens'e aktarılmıştır. Yaklaşık dört haftalık Nicotiana benthamiana bitkilerinin yaprakları bu plazmidleri taşıyan A. tumefaciens hücreleri aracılığıyla infiltre edilmiştir. Kontrol olarak, yapraklar pEAQ-HT-GFP içeren Agrobacterium hücreleri ile paralel olarak infiltre edilmiş ve GFP ışıması 3, 5 ve 7 gün sonra ultraviyole ışık altında görüntülenmiştir. GOI'lerin mRNA düzeyindeki ifadeleri ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlenmiştir. Protein ifadesini göstermek için, toplam çözünür proteinler (TSP) yapraklardan izole edilmiş, Western blot ve ELISA analizleri için kullanılmıştır. Son olarak, VLP'ler çift katmanlı sükroz yastık ultrasantrifüjleme ile saflaştırılmış ve uygun antikorlar (anti-N ve anti-S) kullanılarak Western blot ve ELISA ile analiz edilmiştir. Bu tezde Agrobacterium ko-infiltrasyonlu yaprak örneklerinde tüm GOI'lerin mRNA ekspresyonları doğrulanmıştır. N proteini hem TSP hem de saflaştırılmış örneklerde Western blot ve ELISA analizleri ile tespit edilmiştir. Western blot bant yoğunluğu ve ELISA sonucuna göre N proteininin ekspresyon seviyesinin ER'ye hedeflenmiş örneklerde (VLP-ER), kloroplasta hedeflenmiş örneklere (VLP-Chl) göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma, SARS-CoV-2'nin tüm yapısal proteinlerini içeren VLP'lerin bitki bazlı üretiminin ilk gösterilişidir ve düşük maliyetli ve ölçeklenebilir bir COVID-19 aşısının geliştirilmesine yönelik önemli bir adım olarak kabul edilmektedir.