Dondurma öncesi ve sonrası oosit ve embriyolarda UPR (Unfolding protein response ) sinyal yolunun araştırılması ve preimplantasyon embriyo gelişimine etkisinin araştırılması

AMAÇ Bu çalışmamızda, ER stresinin preimplantasyon embriyo gelişimine olan etkisini ve dondurma (kriyoprezervasyon) çözme tekniğinin oosit ve embriyolarda yaratabileceği olası ER stresine bağlı olumsuz etkiyi Immünofloresan, Western Blot ve RT-PCR yöntemleri ile incelemeyi amaçladık.YÖNTEM Deneysel modelimiz C57BL/6 dişi farelerden superovulasyonu ve in vivo fertilizasyonu takiben iki hücreli embriyolar toplandı .Embriyolar üç gruba ayrıldı: I. Kontrol n=6, II. Tunikamisin (0.5 µg/ml; n=6), III. Sikloheximid (10 µg/ml; n=6), bu gruplar preimplantasyon süreci boyunca inkübe edildiler (2.günden 4. güne kadar) ve gün gün gruplar arasında karşılaştırmalı gelişim analizi yapıldı. İkinci set deneyimiz, kontrol (n=12), kısa dönem tunikamisin (n=12) ve uzun dönem tunikamisin (n=12) ile inkübe edilen deney gruplarından oluşturularak, kısa süreli yada uzun süreli UPR aktivasyonunun etkisi preimplantasyon embriyo gelişiminde araştırıldı. Benzeri olarak üçüncü set deney gruplarımızda elde edilen iki hücreli embriyolar ve olgun oositler 3 gruba ayrıldı; I. grup kontrol, II. grup vitrifikasyon grubu, III. grup yavaş dondurma grubu. Oosit ve embriyolar morfolojik değerlendirmeyi takiben ER stress molekülleri olan BiP ile protein düzeyinde ve BiP, XBP-1 ve sXBP-1 ile de mRNA seviyesinde analiz edildi.BULGULAR Sikloheksimid grubundaki embriyoların preimplantasyon embriyo gelişim süreci boyunca iki hücreli aşamada kaldıkları gözlenirken, kontrol ve tunikamisin gruplarındaki embriyoların preimplantasyon üçüncü günde 8 hücreli aşamayı takiben morfolojik bir fark olmaksızın kompaksiyon düzeyine geldikleri gözlendi. Dördüncü günde ise kontrol grup embriyoların hepsi blastosist aşamasında iken tunikamisinli medyum ile inkübe edilen embriyoların hiçbirinin blastosist aşamasına gelemediğini gözlemledik. Dahası kontrol, kısa dönem ve uzun dönem tunikamisinle inkübe edilen embriyolarda blastosist formasyon oranı sırasıyla; %100, %33, ve %0 idi. Vitrifikasyon ve yavaş dondurma ile dondurulup çözülen oosit/embriyolarda kontrol gruplarına oranla daha yüksek BiP immüno reaktivitesi saptandı. Western blot analizi sonucunda dondurulup çözülen oosit/embriyolar da dondurulmamış gruplardaki oosit/embriyolara oranla daha yüksek BiP protein seviyesi gözlendi ve buna ek olarak RT-PCR analizlerinde dondurulup çözülen oositler/embriyolarda daha yüksek BiP ve sXBP-1 seviyesi saptandı. Ayrıca, yavaş dondurulup çözülen embriyolarda Immünofloresan, Western blot ve RT-PCR analizlerinde vitrikiasyon ile dondurulup çözülen embriyolara oranla daha yüksek BiP seviyesi saptandı.SONUÇ Sonuçta bulgularımız, gelişim sürecindeki embriyoların UPR sinyal yolağını aktive edebilen ER stresinin, preimplantasyon embriyo gelişim sürecine olan etkisinin çok büyük olduğunu göstermiştir. Kısa veya uzun dönem UPR sinyal moleküllerinin aktivasyonu embriyoların kompaksiyon aşamasından sonra gelişimlerini duraklatmaktadır. Dondurma çözme deneylerimiz sonrasında oosit ve blastosistlerin ER stresi aracılı UPR sinyal yolaklarının aktive olmasınun preimplantasyon gelişimide etkisi olduğunu göstermiştir.