E. coli hücrelerinden polimerik mikrokriyojeller ile RNA saflaştırılması

RNA saflaştırma, yaşam bilimlerini konu alan birçok çalışmada, özellikle viral, bakteriyel ve parazitik hastalıkların teşhisinde, kalıtsal bozuklukların diagnozunda, bir dizi hazırlayıcı ve analitik yöntemin kritik bir ilk aşamasını oluşturmaktadır. Bu bağlamda moleküler biyoloji teknikleri uygulamalarıyla hassas ve güvenilir sonuçlar elde etmek için saf ve bozulmamış halde saflaştırılmış RNA molekülleri gerekmektedir. Afinite kromatografisi, iyonik/hidrofobik etkileşimler, hidrojen bağı, disülfür köprüsü gibi moleküler etkileşimler kullanılarak bir karışımdaki belirli bir molekülün veya bir grup molekülün ayrılması, uzaklaştırılması ve saflaştırılması için kullanılan bir yöntemdir. Afinite kromatografisi; antikorlar, enzimler, hormonlar, DNA, reseptörler ve vitaminler dahil olmak üzere birçok biyomolekülün ayrılması ve saflaştırılması gibi biyokimyasal ve biyoteknolojik süreçlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Boronat afinite kromatografisi, cis-diol içeren biyomoleküllerin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan yaygın bir saflaştırma yöntemidir. Son dönemlerde spesifik afinite etkileşimlerinden yararlanan kromatografik stratejileri giderek geliştirilmektedir. RNA'nın ayrılması için geliştirilen ii etkili tekniklerden yararlanarak boronat afinite kromatografisi, cis-diol grupları içeren çok çeşitli biyomoleküllerin biyoseçici ayrımı ve zenginleştirilmesi için umut verici bir yaklaşımdır. Geleneksel partikül bazlı adsorbanlar farklı ölçeklerde kolonlara eklenebilmeleri sebebiyle kromatografide sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle nispeten küçük gözenek boyutlarına sahiptirler ve yavaş difüzyonlu kütle transferi, düşük akış hızları ve yüksek basınç düşüşü gibi bazı dezavantajlara neden olurlar. Bu nedenle, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı adsorbanlar geliştirilmiştir. En iyi bilinen alternatiflerden biri kriyojel bazlı adsorbanlardır. Kriyojeller, sıfır altı sıcaklıklarda jelleşme yoluyla üretilen makro gözenekli polimerik malzemelerdir. Ek olarak, kriyojeller, orijinal kalıbı ölçülerinde monolitik formda hazırlanır ve genellikle sadece kendi şekline uygun olan belirli bir kolonda kullanılır. Sunulan tez kapsamında, istenen ölçek ve şekilde sentezlenebilen mikron boyutlu kriyojeller, mikrokriyojeller olarak adlandırılmıştır, boronat afinite adsorbanı olarak imal edilmiştir. İki farklı türde sentezlenen PHEMA ve poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller, SEM, FT-IR, μCT gibi çeşitli yöntemlerle karakterize edildikten sonra kesikli sistemde optimum adsorpsiyon koşullar belirlenmiştir. Yapılan tez çalışmasında, uygun karakterizasyona sahip olması nedeniyle Poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller kullanılarak optimum koşullar pH 8.5 etilenamin tamponu 0.1 M CaCl2 tuz varlığı 37 oC olarak elde edilmiştir. Sulu çözeltiden RNA adsorpsiyonu deneyleri sonucunda 50. dakikadan sonra adsorpsiyon doygunluğuna ulaşıldığı, 0.5 mg/ml RNA derişiminde maksimum adsorpsiyon kapasitesinin 303 mg/g polimer olduğu bulgusuna erişilmiştir. Adsorpsiyon izotermi inceleme çalışmalarında Langmuir izotermine uygunluk gösterdiği ve ikinci dereceden izoterm kinetiği ile örtüştüğü belirlenmiştir. Mikrokriyojellerin tekrar kullanılabilirlik incelemeleri 8 kez yapılarak sonucunda 223.4 mg/g adsorpsiyon kapasitesi değerine ulaşılmıştır. Tezde, deney ve kontrol kolaylığı sağladığından dolayı biyokimyasal süreçlerde sıklıkla tercih edilen E. coli hücreleri kullanılmış ve E. coli hücrelerinden inkübasyon ve santrifüj işlemleri sonucunda RNA özütü elde edilmiştir. RNA özüt, desorpsiyon ajanı olarak 0.1 M borat tamponu 0.5 M CaCl2 vasıtasıyla yıkanmıştır. Yıkama sonucu agaroz jel elektoforez analizi sonucunda RNA'nın yüksek oranda başarılı şekilde saflaştırıldığı kanıtlanmıştır.