Regulatory role of EML1 in microtubule organization and cell division

Mikrotübüller ve mikrotübül ilişkili proteinler (MİP'ler), hücre içi taşınım, iğ ipliği oluşumu ve hücre bölünmesi gibi çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde kritik rol oynar; bu süreçlerin tümü, düzgün beyin gelişimi ve kortikal organizasyonun sağlanması açısından hayati öneme sahiptir. Bu proteinler arasında yer alan EML1, subkortikal heterotopi ile ilişkilendirilmiştir; ancak mikrotübül organizasyonundaki moleküler rolü ve hastalıkla ilişkili mutasyonların yol açtığı sonuçlar hâlâ tam olarak anlaşılmamıştır. Bu çalışmada, EML1'in düzenleyici rolünü araştırmak amacıyla, HeLa hücrelerinde CRISPR-Cas9 ile oluşturulmuş knockout hücre hattı ve E14.5 günündeki fare ön beyin dokusundan elde edilen Eml1 koşullu knockout nöral progenitör hücreleri kullanılmıştır. GFP ile işaretlenmiş yabanıl tip veya hastalıkla ilişkili T243A mutasyonu taşıyan Eml1 proteinlerinin dıştan ekspresyonu, bu mutasyonun mikrotübül bağlanması ve hücresel fenotipler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Mikrotübül stabilitesini, MİP'lerin mikrotübüllere bağlanmasını, iğ ipliği organizasyonunu ve mitoz ilerleyişini değerlendirmek amacıyla mikrotübül çöktürme deneyleri, konfokal immünofloresan görüntüleme, etiketsiz (label-free) kantitatif proteomik analizler ve canlı hücre görüntüleme yöntemlerinin bir kombinasyonu uygulanmıştır. EML1'in kaybı, taksol ile stabilize edilen mikrotübüllerde azalmaya, çözünür tübülin seviyelerinde artışa, α-tübülin asetilasyonunda azalmaya ve mikrotübül depolimerizasyonunu indükleyen nokodazol maddesine karşı hücrelerin artan duyarlılığına yol açmıştır. Bu değişimlere, EML4 ve SEPTIN2 gibi diğer MİP'lerin mikrotübüllere olan bağlanmalarının azalması eşlik etmiş, ancak bu proteinlerin toplam düzeylerinde bir değişiklik gözlenmemiştir. EML1'in, EML4'ün mikrotübül ağına bağlanması için gerekli olduğu gösterilmiş; EML1'in yokluğunda EML4'ün mikrotübüllere bağlanması anlamlı düzeyde azalmış ve bu durum, mikrotübül organizasyonu ve mitotik düzenin bozulmasına katkıda bulunmuş olabilir. Özellikle, mitotik iğ organizasyonundaki bozukluklar ve hücre bölünmesinin uzaması gibi mitotik kusurlar, yabanıl tip EML1 ile kurtarılmış; ancak mikrotübül bağlanması bozulmuş ve agregasyon gösteren T243A mutantı bu fenotipleri kurtaramamıştır. Hücre döngüsüne özel yapılan proteom analizleri, EML1'in interfaz ve mitoz fazlarında kısmen farklı protein kompleksleriyle etkileşime girdiğini ortaya koyarak, hücre döngüsü boyunca etkileşim ağının dinamik şekilde düzenlendiğini göstermiştir. Ayrıca, daha önce EML1 ile ilişkisi bildirilmemiş olan mitotik bir kinaz olan NEK9, Eml1-GFP pull-down örneklerinde tekrarlı olarak saptanmış ve bu durum olası yeni bir etkileşimi düşündürmektedir. Önemli olarak, EML1 hücre bölünmesi sırasında EML4'ün dinamik lokalizasyonunu düzenler. EML1 knockout hücrelerinde EML4, iğ iplikleri ve orta bölge mikrotübülleri üzerinde anormal birikim gösterirken, Eml1-GFP ile yapılan geri kazandırma normal dağılımını yeniden sağlar. Sonuç olarak, EML1, mikrotübül stabilitesi, MİP etkileşimleri ve mitotik organizasyonun merkezi bir düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır. EML1'in kaybı veya mutasyonu, hücre iskeletinin bütünlüğünü ve mitotik doğruluğu bozmakta; bu durum, EML1 ile ilişkili heterotopinin patogenezine dair mekanistik bir bakış açısı sunmakta ve potansiyel tedavi hedeflerini işaret etmektedir.