Escherichia coli'de trans-sinnamik asit ve p-kumarik asit ile ilgili genlerin ve metabolitlerin araştırılması

Fenolik bileşikler doğada oldukça yaygın olarak bulunan, insan diyetinde geniş bir yere sahip olan ve geniş spektrumlu biyolojik aktiviteye sahip doğal bileşiklerdir. Tez çalışmamızda kullandığımız trans-sinnamik asit ve p-kumarik asit fenolik asitler sınıfının birer üyesi olup fenolik bileşikler grubuna aittirler. Yapılan literatür taramalarında trans-sinnamik asit ve p-kumarik asitin antibakteriyel, antibiyofilm, antifungal, antikanser gibi çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahip olduğu tespit edilmiştir ancak bu aktivitelerini hücre içerisindeki hangi yolaklar ile ilişkili olarak gerçekleştirdiği henüz aydınlatılmamıştır. Bu tez çalışmasında Escherichia coli'de trans-sinnamik asit ve p-kumarik asit ile ilgili genler ve metabolitlerin araştırılması hedeflenmiştir. Bu tez çalışmasında öncelikle ASKA klon seti plazmid kütüphanesi kullanılarak, gradient ekim yöntemi ile kontrole kıyasla toleranslı klonlar tespit edilmiştir. Kontrole kıyasla göreceli olarak, Trans-sinnamik asitten 99, p-kumarik asitten 100 adet suş seçilmiştir. Ardından ilk seleksiyon için artan fenolik asit konsantrasyonu içeren besi ortamlarında, çizgi ekim deneyleri gerçekleştirilmiştir. Çizgi ekim deneylerinde kontrole kıyasla göreceli olarak toleranslı suşlar tespit edilmiştir. Seçilen suşların içerdikleri plazmidlerdeki insertlerin varlığının ve büyüklüğünün tespiti için koloni PCR deneyleri gerçekleştirilmiştir. Koloni PCR deneylerinde farklı insert büyüklüğüne sahip klonlardan plazmid izolasyonu yapılmıştır. İzole edilen plazmidlerin içerdikleri insertlerin nükelotid dizileri Sanger Sekanslama yöntemi ile aydınlatılmış ve ardından elde edilen nükelotid diziler biyoinformatik analizlere tabi tutulmuştur. Yapılan biyoinformatik analizler sonucunda trans-sinnamik aside toleranslı suşların, prpE, yddL, flhD, sbmC, p-kumarik aside toleranslı suşların, pgaB, prpE, dinI, bax ve yadI olduğu tespit edilmiştir. Tez çalışmasının son aşamasında, NMR (Nükleer Manyetik Rezonans) Teknolojisi kullanılarak, Escherichia coli BW25113 suşunun, trans-sinnamik asit ve p-kumarik aside cevabında rol oynayan metabolitler araştırılmıştır. BW25113 suşu artan konsantrasyonlarda trans-sinnamik asit ve p-kumarik aside maruz bırakılarak metabolit ekstraktları elde edilmiş ve 1H-NMR analizleri gerçekleştirilmiştir. Trans-sinnamik asit maruziyeti sonrası BW25113 suşunun pantotenat, pridoksin, adenin, sellobiyoz ve nikotinat metabolitlerinde artış, piroglutamat, etilen glikol, gliserol, IMP, UMP ve sükroz metabolitlerinde azalış olduğu tespit edilmiştir. Pathway (Yolak) analizlerinde ise, Pentotenat ve CoA biyosentezi, Gliserolipid Metabolizması, Galaktoz Metabolizması, Primidin Metabolizması, Pürin Metabolizması, Glioksilat ve Dikarboksilat Metabolizması, Glutatyon Metabolizması ve Vitamin B6 Metabolizmasının etkilendiği tespit edilmiştir. p-kumarik asit maruziyeti sonrası BW25113 suşunun ADP, sitozin, dTTP, fumarat, etanol, inozin metanol, oksipurinol ve UMP metabolitlerinde artış, asetamid, kolin, cis-akonitat, hidroksiaseton, hipoksantin, süksinat ve pantotenat metaboliterinde azalış olduğu tespit edilmiştir. Pathway analizlerinde ise, Pürin Metabolizması, Primidin Metabolizması, Pirüvat Metabolizması, Pentotenat ve CoA Biyosentezi, Gliserolipid Metabolizması, Beta-Alanin Metabolizması, Glioksilat ve Dikarboksilat Metabolizması, Glutatyon Metabolizması, TCA Cycle, Nikotinat ve Nikonamid Metabolizması ve Butanoat Metabolizmasının etkilendiği tespit edilmiştir.