Fare embriyonik kök hücresinden farklılaştırılan epidermal seri hücrelerinden keratinositlerin primer yara iyileşiminde kullanımı

Deri vücudun iç ortamının bütünlüğü ve çevreye karşı korunmasında hayati bir rol oynar. Yanık ve deri yaralanmalarının en az hasarla tedavi edilmesi için doku mühendisliğince otolog veya allojenik olarak embriyonik veya erişkin kök hücrelerinden oluşturulan deri greftlerinin oluşturulması ve kullanımı gündemdedir. Pluripotent olan embriyonik kök hücreler uygun kültür ortamı sağlandığında farklılaşmadan çoğaldıkları gibi, ortamın değiştirilmesi ile farklılaşmaları sağlanabilir. Bu çalışmada amacımız fare embriyonik kök hücrelerinden farklılaştırılan keratinositlerin, farede oluşturulan cerrahi yara modeline transfer edildikten sonra yara iyileşmesine ve yara iyileşmesi sırasında salgılanan moleküllere etkilerinin araştırılmasıdır.Embriyonik kök hücrelerden embriyoblastlar oluşturularak matrijel ve BMP-4 içeren kültür ortamında keratinosit benzeri hücreler elde edildi. Farklılaştırılan keratinositler % 4' lük paraformaldehit ile tespit edildikten sonra sitokeratin-8 ve sitokeratin-14 dağılımları immunohistokimyasal teknik ile, hücrelerin ultrastrüktürel özellikleri, gluteraldehit ve osmik asit ile tespit edildikten sonra agara gömülerek tanımlandı. Farklılaştırılan hücreler yara yerine transfer edilmeden önce Brd-U ile işaretlendi. Deneysel cerrahi yara modeli oluşturmak üzere 60 adet Bulb C tipi fareler dört eşit gruba ayrıldı [deney (n=15), sham (n=15), kontrol (n=15), ve sağlam deri (n=15)]. Sağlam deri grubuna hiçbir işlem uygulanmadı buna karşılık kontrol grubunda sadece yara oluşturuldu. Sham grubunda yara oluşturulduktan sonra sadece mesh transfer edilirken, deney grubunda kültür ortamında elde edilen keratinositler mesh üzerinde yaraya transfer edildi. Tüm gruplardan cerrahi müdahalenin 3., 5. ve 7. günlerinde doku örnekleri ışık ve elektron mikroskobik inceleme için alındı. Işık mikroskobik inceleme için alınan doku örnekleri % 10 formalin ile tespit edildi ve rutin parafin takip işleminden sonra alınan seri kesitlerin bir kısmı H-E ve Masson Trikrom ile diğer kesitler ise sitokeratin-8, sitokeratin-14, EGF, IL-8, FGF-1, FGF-2, MCP-1 ve kollajen-1 dağılımlarını belirlemek için indirekt immunoperoksidaz yöntemi ile boyandı. Brd-U ile işaretlenmiş hücrelerin analizi için anti-Brd-U boyaması yapıldı. Elektron mikroskobik inceleme için alınan doku örnekleri gluteraldehit ve osmik asit ile tespit edilip epona gömülerek yarı ince ve ince kesitler alındı.Kültür ortamında farklılaştırılan hücrelerin, erken ve geç dönem keratinosit farklılaşma belirteçleri olan sitokeratin-8 ve 14 immunoreaktivitelerinin pozitif olması ve ultrastrüktürel olarak benzer özellikleri taşıması, keratinosit benzeri hücreler olduklarını düşündürdü. Işık mikroskobik incelemede 3. günde deney grubunda yara bölgesinde keratinosit hücrelerinden oluşan epitelizasyon gözlenirken kontrol ve sham gruplarında yara yeri kenarlarında keratinosit hücrelerinin henüz proliferasyonunun başladığı ve epitelizasyonun olmadığı gözlendi. Üçüncü günden itibaren deney grubunda yara bölgesine Brd-U ile işaretlenerek transfer edilen hücrelerin çekirdeklerinin, anti-Brd-U boyaması ile pozitif olarak boyandığı gözlendi. İndirekt immunohistokimyasal incelemede, sitokeratin-8 immunoreaktivitesinin, kontrol grubunda 3. ve 5. günde negatif, 7. günde pozitif; deney grubunda ise 3. ve 5. günde pozitif, 7. günde negatif olduğu tespit edildi. Sham grubunda, sitokeratin-8 immunoreaktivitesinin her üç günde de pozitif, sağlam deride ise her üç günde de negatif olduğu izlendi. Sitokeratin-14 immunoreaktivitesi sağlam deride 3., 5. ve 7. günde kuvvetli pozitif boyanırken, deney, kontrol ve sham gruplarında ise, 3. günde zayıf şiddette veya negatif olarak saptandı. Kontrol ve sham gruplarında 5. ve 7. günlerde sitokeratin-14 immunoreaktivitesi orta şiddette, deney grubunda ise şiddetli pozitif olarak gözlendi. EGF immunoreaktivitesi, sağlam deri grubunda her üç günde de negatif iken, deney, kontrol ve sham gruplarında 3. günde negatif, 5. ve 7. günlerde özellikle 7. günde deney grubunda daha fazla olmak üzere her üç grupta da pozitif boyandığı saptandı. IL-8 immunoreaktivitesi, sağlam deri grubunda her üç günde de negatif, deney ve kontrol grubunda 3. günde en fazla olmak üzere tüm günlerde pozitif olduğu, sham grubunda 3. ve 7. günde zayıf, 5. günde ise orta şiddette olduğu izlendi. FGF-1 immunoreaktivitesinin tüm gruplarda ve 3., 5. ve 7. günlerde negatif olduğu gözlendi. FGF-2 immunoreaktivitesi, tüm gruplarda ve 3., 5. ve 7. günlerde pozitif olarak gözlenir iken, 5. günde FGF-2 immunoreaktivitesine sahip hücrelerin deney grubunda daha fazla olduğu saptandı. MCP-1 immunoreaktivitesinin sağlam deri grubunda her üç günde de bağ dokusu içerisinde zayıf şiddette olduğu gözlenir iken deney, kontrol ve sham gruplarında 3. ve 5. günde orta şiddette pozitif, 7. günde deney grubunda yine orta şiddette, kontrol ve sham grubunda ise giderek azalan şiddette olduğu saptandı. Kollajen-1 immunoreaktivitesinin sağlam deri grubunda dermiste pozitif olduğu ve günler arasında fark olmadığı gözlenir iken 3. günde deney grubunda negatif, kontrol ve sham grubunda zayıf şiddette ve 5. ve 7. günlerde giderek azaldığı, deney grubunda ise giderek arttığı izlendi. Örneklerin elektron mikroskobik incelenmesinde 3. günden itibaren deney grubunda epitelizasyonun başladığı ve keratinositlerin yara bölgesinde yer aldığı gözlendi.Fare embriyonik kök hücrelerinden farklılaştırılan keratinositlerin, farede oluşturulan cerrahi yara bölgesine transferini takiben anti-Brd-U ile boyanmış olması varlıklarını devam ettirdiklerinin bir göstergesi olarak değerlendirildi. Farklılaştırılan hücrelerin, yara bölgesinde yara iyileşmesinde rol oynayan moleküllerden kollajen-1, EGF ve sitokeratin-14 salınımının geç dönemde; sitokeratin-8, IL-8, FGF-2 ve MCP-1 salınımının ise erken dönemde artışına neden olduğu tespit edildi. Farklılaştırılan hücrelerin yara iyileşmesi evrelerini hızlandırdığı ve yara iyileşmesi üzerine olumlu etki yaptığı sonucuna varıldı.