536
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
Besin kısıtlamasının ve açlığın gebe farelerin plasentalarında ve fetuslarında otofaji ve sirtuin belirteç düzeylerine etkisi
Açlık genel anlamda insanlarda 12 saat ile üç hafta periyotları arasında değişen hiç veya az miktarda yiyecek alınmasıdır. Besin kısıtlaması; tüm besin değerlerinin değiştirilmeden ad libitum diyetinin(günlük gıda alınımı) yüzdesel olarak azaltılması olarak tanımlanır. Otofaji, çeşitli stresli durumlara besin yoksunluğu, oksidatif stres ve DNA hasarı gibi cevaben hücresel homeostazı korumak için uyarıldığı bilinmektedir. Otofajinin düzenlenmesinde Sirt1 ve Sirt2 için çok yönlü rolleri tanımlamıştır. Sirt1, otofajiyi, otofaji genlerinin (Atg) 5, 7 ve 8 ürünleri gibi otofaji indüksiyon ağının temel bileşenlerinin deasetilasyonu yoluyla doğrudan etkilediği bilinmektedir. Bu çalışmada fareler kontrol, Oruç, S-24, S-48, 1W, 2W, 3W olmak üzere 7 gruba ayrıldı. Gebeliğin 18.5 gününde anneden fetüs ve plasenta alınarak ağırlıkları ve boyları değerlendirildi. Besin kısıtlaması ve açlık uygulanmış farelerin SİRT1, SİRT2, ATG5 ve LC3/AB gibi genlerin organ bazında ve plasenta bölgesel açısından immünohistokimyasal ekspresyon düzeylerine bakıldı. Morfolojik değerlendirme için fetüs ve plasentaların Hematoksilen- Eozin boyamaları yapıldı. Deney sonuçlarına göre besin kısıtlaması ve çeşitli açlık uygulamalarının maternal farelerin fetüs ve plasenta ağılık ve boy ölçümleri arasında anlamlı olarak düşük saptanmıştır. Besin kısıtlaması ve açlık gruplarında immünohistokimyasal sonuçlarına göre plasentada anlamlı bir farklılık görülmemiştir. Ancak fetüs için organ bazında SIRT-1 belirteci için kalp ve sol ekstremite, ATG-5 belirteci için bağırsak ve LC3/AB belirteci için ise karaciğer dokularında anlamlı bulgular bulunmuştur. Bu çalışmanın deney sonuçları doğrultusunda besin kısıtlaması ve çeşitli açlık grupları ve SIRT-1, ATG-5 ve LC3/AB belirteçleri etkili olmakta ve ekpresyon düzeylerini etkilemektedir.
Doksorubisin uygulanan sıçanlarda apelin-13 molekülünün karaciğere etkisi
Bu çalışmanın amacı sıçanlarda doksorubisin verilerek oluşturulan karaciğer hasarının, apelin-13 verilerek histopatolojik ve biyokimyasal olarak giderilip giderilmediğini göstermektir. Çalışmada 30 adet erkek Wistar albino cinsi sıçan kullanıldı. Sıçanlar her grupta 10 sıçan olacak şekilde 3 gruba ayrıldı; 1.Grup(kontrol grubu): 14 gün boyunca her gün 3ml/kg intraperitoneal olarak salin verildi. 2.Grup(DOX grubu): 5 mg/kg doksorubisin 4 günde 1 toplam 20 mg/kg olacak şekilde intraperitoneal olarak uygulandı. 3.Grup(DOX+apelin-13): 5 mg/kg doksorubisin 4 günde 1 toplam 20 mg/kg olacak şekilde intraperitoneal olarak uygulandı. Deneyin 2. haftasının başlangıcından itibaren 7 gün boyunca 15 µg/kg apelin-13 intraperitoneal olarak verildi. Deney sonunda sıçanlara ksilazin 5mg/kg, ketamin 100 mg/kg verilerek anestezi altında sakrifiye edildi. Yapısal (Hematoksilen-eozin, Masson trikrom, Pikro sirius ve NF-κB antikoru) ve biyokimyasal (ALT, AST, TAS, TOS ve hidroksiprolin) değerlendirmelerin yapılması için karaciğer dokusu ve kan numuneleri alındı. Hematoksilen-eozin ile boyanan karaciğer dokularında kontrol grubunda normal histolojik yapı görülmüştür. DOX verilen grupta hepatositlerde piknotik çekirdek, sentrilobüler nekroz, sinüzoidal dilatasyon ve yaygın dejenerasyon gözlendi. Apelin-13 verilen grupta tüm parametrelerde belirgin iyileşme gözlenmiştir. Masson trikrom ve Pikro sirius boyamalarında 3 grup arasında belirgin farklılık saptanmamıştır. NF-κB antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyamada DOX grubunun kontrol grubuna göre daha yoğun boyandığı saptanmıştır. Apelin-13 verilen grupta sadece DOX verilen gruba göre NF-κB ile boyanma yoğunluğunun azaldığı gözlenmiştir. Yapılan biyokimyasal değerlendirmelerde DOX grubunda kontrol grubuna göre ALT, AST, hidroksiprolin ve TOS düzeylerinde kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış saptandı. DOX grubunda TAS düzeylerinde kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalma saptandı. DOX+apelin-13 verilen grupta DOX grubu ile kıyaslandığında ALT ve TOS değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma saptanmıştır. DOX ve DOX+apelin-13 grupları arasında AST, TAS ve hidroksiprolin değerleri açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmamıştır. DOX+apelin-13 grubunda kontrol grubuna göre hidroksiprolin değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış saptanmıştır. Kontrol grubuna göre DOX+apelin-13 grubunda ALT, AST, TAS ve TOS değerleri açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. Elde ettiğimiz veriler doğrultusunda apelin-13 uygulamasının, DOX'a bağlı oluşan karaciğer hasarını; reaktif oksijen radikallerinin miktarını azaltarak belirgin bir ölçüde azalttığını gözlemledik.
Gebe sıçanlarda yüksek doz kafein uygulamasının fetüs hipokampusunda oluşturduğu hasar üzerine melatoninin olası etkisinin incelenmesi
Kafein, hemen hemen her gün hepimizin yaygın olarak tükettiği ve merkezi sinir sistemi üzerinde uyarıcı etkiye sahip olan nörolojik açıdan aktif gıda bileşenidir. Metilksantin'ler grubunda (1,3,7-trimetilksantin) yer alan kafein, dünyada kullanımı en sık olan psikoaktif maddedir. Diğer psikoakftif maddelerin aksine hem yaygın hem de yasaldır. Kafein ve türevleri kahve, çay, kola ve çikolata gibi birçok tüketilen içecek ve yiyeceklerde bulunmaktadır. Kafeinin insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri 1900'lü yılların başlarında incelenmeye başlanmıştır. Son zamanlarda yapılan araştırmalara göre günde ortalama 300 mg'dan daha fazla kafeinin tüketildiği belirtilmiştir. Kafeinin, günlük normal doz aralığı yaklaşık olarak 50-300 mg olarak belirtilmekte ve kişiye uyanıklık hali, enerji ve konsantre olmasını sağlar. Aşırı doz tüketiminde ise yani 300-800 mg ve üstü kişide uyku bozukluğu, sinirlilik, endişe, panik atak ve kaygı hallerine sebep olduğu belirtilmiştir. Günlük kafein kullanımında, kadınların yaklaşık olarak %80'i tüketmektedir ve hamilelik sırasında bile geniş bir kafein tüketiminin olduğu yapılan çalışmalar sonucu ortaya çıkmıştır. Özellikle gebelik döneminde tüketilen kafeinin, fetüs üzerinde olumsuz birçok etkiye yol açtığı belirtilmektedir. Bunun temel nedeni ise annenin aldığı kafeinin, plasenta bariyerini kolayca geçebilmesinden kaynaklanmaktadır. Kafein metabolizması için gerekli enzim olan, Sitokrom P450 A2, plasenta ve fetüste yoktur. Dolayısıyla yeterli enzim sisteminden yoksun olan fetüs, kafeini metabolize edilmesi oldukça uzun zaman alır ve bundan dolayı fetüs için bir risk faktörü oluşturur. Gebelik döneminde yüksek dozlarda alınan kafein, plasenta bariyerini hızla geçerek, fetal gelişim geriliği (intrauterin gelişim geriliği), başta olmak üzere düşük doğum ağırlıklı bebek, prematüre doğum, spontan abortus ve ölü doğum gibi pek çok olumsuz tablo sergilemektedir. Melatonin, epifiz veya pineal olarak isimlendirilen bezden, karanlıkta salgılanan uyku, biyolojik ritim, üreme ve immünite gibi birçok biyolojik fonksiyonun düzenlemesinde rol oynayan endojen bir hormondur. Çok sayıdaki çalışmada, melatoninin nöroprotektif etkisi olduğu ve sinir rejenerasyonunu artırdığı gösterilmiştir. Bu bilgilerden yola çıkarak, bu çalışmada, gebe sıçanlarda yüksek doz kafein uygulamasının fetüs hipokampusunda oluşturduğu hasar üzerine melatoninin olası etkisinin incelenmesini amaçladık. Çalışmamızda, 32 erişkin ''Wistar albino'' dişi sıçan kullanıldı. Dişi sıçanlar rastgele her bir grupta 8 adet (n=8) olacak şekilde; kontrol, melatonin, kafein ve kafein+melatonin olmak üzere dört gruba ayrıldı. Gebeliğe bırakılan dişi sıçanlar, gebelik döneminin 9. gününde gruplarına göre maddeler uygulandı. Kontrol grubuna, herhangi bir madde uygulanmadı. Melatonin grubu (MEL grubu), gebeliğin 9. günü ile 20. günü her gün periton içi (intraperitoneal; i.p.) saat 16.00-17.00 arası 10 mg/kg/gün dozunda i.p. melatonin enjekte edildi. Kafein grubu (KFN grubu) gebeliğin 9. günü ile 20. günü arası her gün i.p. 60 mg /kg/gün kafein enjekte edildi. Kafein+ melatonin grubu (KFN+MEL grubu), gebeliğin 9. günü ile 20. günü her gün i.p. 60 mg/kg/gün kafein enjekte edildi. İlaveten, aynı günlerde saat 16.00-17.00 arası 10 mg/kg/gün dozunda i.p. melatonin enjekte edildi. Çalışmaya dahil olan 32 adet "Wistar albino" cinsi gebe sıçandan gebeliklerinin 21. gününde alınan fetüslerin beyni çıkarıldı. Tüm gruplardaki fetusların hipokampal bölgeleri tespit işlemi yapıldıktan sonra; Hematoksilen&Eozin ve Cresyl echt violet ile boyanarak histololjik açıdan ayrıca GFAP ve Synaptophysin ile immunohistokimyasal boyma yöntemiyle incelendi. Anahtar Kelimler: Fetus, gebe sıçan, hipokampus, kafein, melatonin.
Sepsis modeli oluşturulan sıçanlarda karaciğer hasarı üzerine borik asitin koruyucu etkisi
Endotoksik şok (sepsis) hipotansiyon, zayıf doku perfüzyonu ve çoklu organ yetmezliği ile karakterize edilen ve yatan hastalarda ölüme neden olan etkenlerin başında gelen ciddi bir komplikasyondur. Başta lipopolisakkarit (LPS) olmak üzere endotoksinler tarafından oluşturulan endotokseminin patofizyolojik mekanizmalarının anlaşılmasında ve tedavisinde pek çok strateji geliştirilmesine rağmen, hala yoğun bakım ünitelerinin büyük bir problemidir. Günlük diyetimizin bir parçası olan borik asit; bor elementinin en sık görülen formlarından biridir; Bor vücuda daima borik asit olarak alınmakta ve plazmada bu formda bulunmaktadır. Bazı epidemiyolojik veriler borik asitin erkeklerde prostat kanseri; kadınlarda serviks ve akciğer kanseri görülme oranlarını azalttığına dikkat çekmektedir. Borik asit doğada yaygın olarak bulunan bir mineral ürünüdür ve geleneksel tıp uygulamaları yanında tarım, sanayi ve kozmetik sektöründe de sıklıkla kullanılmaktadır. Borik asit vücuda alındıktan sonra hızla absorbe edilir ve pasif difüzyon aracılığı ile tüm vücut sıvılarına dağılır. Bazı çalışmalar hem insan hem de sıçanlarda borik asitin kan doku dağılım oranının 1:1 olduğunu göstermektedir. Borik asitle yapılan deneysel çalışmalar; doz bağımlı bir şekilde borik asitin bazı prostat, melanom ve mide kanseri hücre hatlarında, hücre proliferasyonunu azalttığını ve apoptozu uyardığını göstermektedir. Bu araştırmada son yıllarda immün sistemde, kemik gelişiminde, hormon metabolizmasında ve özellikle antioksidan sistemde çok etkili olduğuna dair araştırmalar yapılan borik asitin sıçanlarda oluşturulacak deneysel endotoksemideki karaciğeri koruyucu etkinliğini belirlemek amaçlanmıştır. Çalışmada, Wistar albino türü (200-300gr ağırlığında) dişi sıçanlar kullanılacaktır. LPS uygulanan gruplar 10 hayvan, kontrol grupları 6 hayvan olacak şekilde toplam 32 hayvan ile çalışma planlanmıştır.
Endotokseminin neden olduğu over hasarı üzerine borik asitin koruyucu etkisi
Sepsis, vücutta bakteri ya da toksin varlığında geliĢen enfeksiyona karĢı tüm vücudun vermiĢ olduğu ciddi bir reaksiyondur. Vücut; immun sistemi tarafından kandaki, idrardaki, akciğerlerdeki, ciltteki ya da baĢka bir dokudaki mikroplara tepki olarak bu enflamatuar cevabı verebilir. Sepsis, destek tedavileri, antibiyotikler, immünoterapi ajanları ve yeni geliĢen tedavi alternatiflerine karĢın, yaklaĢık %90 civarında yüksek düzeyde mortalite oranı göstermektedir ve yoğun bakım ünitelerinde ölüme en fazla sebebiyet veren bir sağlık problemi Ģeklinde karĢı karĢıya kalınmaktadır. Bundan dolayı sepsis insanlarda en fazla araĢtırılan hastalıklardan olup aynı zamanda deneysel hayvanlarda en fazla çalıĢma yapılan modellerden bir tanesi olarak bilinmektedir. Endotoksemi; kandaki endotoksin bakteri varlığını ifade etmektedir. Kandaki biriken bu bakteriler endotoksin sepsisini meydana getirmektedir. Borik asit; bor bileĢiklerinin içerisinde en yaygın olan mineral asittir ve suda kolaylıkla çözünebilmektedir. Borik asit antioksidan ve antienflamatuar özelliklere sahiptir. Tıbbi ürünlerde ve tıbbi tedavi yöntemlerinde sıkça kullanılmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda, çalıĢmamızda; bakteriyel endotoksin olan lipopolisakkaritle (LPS) sepsis oluĢturup, bir doğal maden olan ve birçok alanda kullanılan bordan elde edilen borik asitin koruyucu etkisi incelenmiĢtir. AraĢtırmamızda 32 adet Wistor Albino cinsi diĢi sıçan kullanılmıĢ olup 4 gruba ayrılmıĢtır. Borik asit ve borik asit+LPS grubundaki sıçanlara 14 gün boyunca sabah aynı saatte intraperitoneal yolla 20 mg/kg borik asit enjekte edildi. 14. gün akĢam borik asit+LPS ve LPS grubundaki sıçanlara 7,5 mg/kg LPS intraperitoneal yolla verilerek sepsis oluĢturuldu. Sepsis oluĢumu gözlemlendikten sonra sıçanlara uygun dozlarda 10 mg/kg intraperitoneal yolla ksilazin ve 60 mg/kg ketamin hidraklorür uygulanarak anestezi oluĢturuldu. Anestezi uygulanan sıçandan ovaryum dokuları cerrahi yöntemle alınarak servikal dislokasyon ile sakrifiye edildi. Alınan doku örnekleri ıĢık mikroskobik incelemeleri için doku hazırlama yöntemlerine uygun bir Ģekilde hazırlandı. Ayrıca her gruptan alınan ovaryum dokuları alimünyum folyaya sarılarak biyokimyasal incelemler için saklandı. OluĢan endotoksemi sonucunda borik asitin ovaryum histopatolojisi ve ovaryum fonksiyonları üzerinde oluĢturduğu koruyucu etkisi incelendi. Ġncelemeler sonucunda follikül sayımı yapılan gruplar değerlendirildi. Primer follikül düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı bir değiĢiklik gözlemlenmedi. LPS grubunda primordiyal follikül sayılarında azalma anlamlı seviyedeydi. LPS grubu diğer gruplarla karĢılaĢtırıldığında kontrol, borik asit, borik asit+LPS gruplarına göre sekonder follikül sayılarında azalma gözlenirken aynı zamanda atretik folikül sayılarında ise artıĢ olduğu gözlemlendi. BA+LPS grubunda sekonder ve graaf follikül miktarlarının kontrol ve BA grubu ile birbirine benzer olduğu aynı zamanda atretik follikül miktarlarının ise LPS grubuna kıyasla anlamlı seviyede arttığı gözlemlendi. LPS grubunda bulunan tüm folliküllerde ve bağ dokusu alanlarda dejenerasyon gözlemlendi. Sonuç olarak, LPS verilen sıçanların ovaryumunda korteks damarlarında fibrozis meydana geldiği, follikül kaybı meydana geldiği aynı zamanda ovaryum doku skarlaĢmasının primordiyal folliküller üzerinde toksisiteye sebebiyet verdiği saptandı. Yaptığımız bu çalıĢmada LPS ile oluĢturulan endotokseminin sıçan ovaryum hasarında Borik asitin koruyucu etkisinin olduğu kanısına varıldı. Ağustos 2024, 71 sayfa Anahtar kelimeler: Borik Asit, Over, Sepsis, Enfeksiyon, Endotoksemi
Nonilfenol ile oluşturulan nörotoksisitede alfa lipoik asitin etkilerinin araştırılması
daha sonra doldurulacaktır
Karaciğer fibrozis modeli: Farklı dozlarda nonylphenol maruziyetinin hepatotoksik etkilerinin incelenmesi
Nonilfenol (NP), endüstriyel ve evsel ürünlerde yaygın olarak kullanılan, çevreye kolayca sızabilen ve endokrin bozucu etkileri ile bilinen bir kimyasaldır. Karaciğer, toksik maddelerin metabolizmasında merkezi rolü nedeniyle NP maruziyetinde öncelikli hedef organlardan biridir. NP maruziyeti, fibrozis gelişimi de dahil olmak üzere ciddi yapısal ve fonksiyonel bozukluklara yol açabilmektedir. Bu çalışma, farklı dozlarda NP maruziyetinin sıçanlarda karaciğer dokusu üzerindeki toksik etkilerini ve olası doz-bağımlı değişimleri değerlendirmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Kontrol, sham, düşük doz (NP1), orta doz (NP2) ve yüksek doz (NP3) olmak üzere beş grup oluşturulmuştur. Deneyin 1. ve 16. günlerinde ölçülen vücut ağırlıkları değerlendirilmiş; kontrol grubunda anlamlı kilo artışı gözlenirken (p<0,05), yüksek doz NP3 grubunda anlamlı kilo kaybı saptanmıştır (p<0,01). Deney sonunda organ ağırlıkları kaydedilmiş ve karaciğer ağırlıkları NP3 grubunda (p<0,01), ayrıca NP2 grubunda (p<0,05) kontrol grubuna kıyasla anlamlı olarak artmıştır. Histopatolojik incelemede, NP maruziyeti ile hepatosit dejenerasyonu, sinusoidal genişleme, portal bölgede inflamatuar hücre infiltrasyonu ve fibrotik değişiklikler belirginleşmiştir. İmmünohistokimyasal analizler, NP uygulamasının karaciğer dokusunda TGF-β1, TLR-4 ve α-SMA ekspresyonlarını anlamlı düzeyde artırdığını göstermiştir. Özellikle TGF-β1 ekspresyonu, tüm NP gruplarında kontrol ve sham gruplarına göre yüksek bulunmuş (p<0,001), TLR-4 ekspresyonu doz artışıyla paralel olarak anlamlı farklılıklar göstermiştir (p<0,001). α-SMA ekspresyonu yalnızca NP2 ve NP3 gruplarında anlamlı şekilde artarken (p<0,001), doz-bağımlı artış hem NP1–NP3 hem de NP2–NP3 karşılaştırmalarında istatistiksel olarak desteklenmiştir (p<0,001). Biyokimyasal değerlendirmelerde, malondialdehit (MDA) düzeylerinde anlamlı yükselme (p<0,001) ve süperoksit dismutaz (SOD) aktivitelerinde belirgin azalma (p<0,001) gözlenmiştir. Elde edilen bulgular, nonilfenolün yüksek dozlarda oksidatif stres, inflamasyon ve fibrozis mekanizmalarını aktive ederek karaciğerde histopatolojik hasara neden olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, NP maruziyeti oksidatif strese bağlı organ toksisitesinde önemli bir risk faktörü olup, toksik etkinin doz ile arttığı sonucuna varılmıştır.
Analysis of sperm cytoplasmic mRNA content with special reference to the storage temperature and its possible impact on early embryonic development
Aims: The current study aims to investigate five mRNA necessary for chromatin decompaction and demetilation and mRNA degradation in Oryctolagus cuniculus sperm cytoplasm. The investigation was implemented on three groups, one fresh control and two stored at different temperatures such as 4°C and 15°C to investigate also an impact of storage temperature on possible mRNA self decay. The results would be beneficial for understanding of maternal – paternal genes interplay during the very first hours of the embryonic development and the impact of paternal genes on the basic tasks implementation just before the embryonic genome activation (EGA). This knowledge would help to improve ART success rates by development better medium, storage and ICSI techniques for the cases with unexplained infertility. Materials and Methods: Sperm for the current project was collected once or twice a week (during 7 weeks) using artificial vagina from adult male rabbits known to be fertile. After dilution, the samples were divided into two equal groups. The first group of the samples was stored at 4°C and the second one was stored at 15°C for 72 hours. At the end of this period, a freshly taken ejaculate after examinations was also added as a control group (without previous storage). The mRNA was isolated, cDNA synthesized and qRT-PCR performed. For the gene expression comparison among the groups the ΔCT method was used as a normalization method, and the Independent Samples one-sided T Test was used to decide on the significance of the intergroups differences with the 0.05 level of significance. Statistic analyses were performed using SPSS (Statistical Packag for Social Sciences) for Windows 22. xiv Results: The study has confirmed that sperm cytoplasm indeed contains paternally produced mRNA, and this study could determine five gene transcripts in Oryctolagus Cuniculus sperm cytoplasm: CNOT1, CNOT8, TET3, NPM2 and XRN1. Moreover, CNOT8 and CNOT1 were present the most, XRN1 and NPM2 were present the least. According to the Independent Samples T Test, TET3 transcripts' sensitive to low storage temperatures was claimed with 87% of statistical power at 0.95 significance. Conclusion: The current study has met it's research goals succesfully. It has added valuable research data to the field of research in sperm cytoplasmic content and to the whole field of embryology. This research contribution has also added to the field of knowledge on Oryctolagus cuniculus species.
Primer ve metastatik insan kolon kanseri hücre hatlarındaα-laktalbumin ve sulindac'ın mitokondriyal apoptotik yolaküzerinden etkisinin immünohistokimya ve elektronmikroskobik yöntemlerle değerlendirilmesi
Kanserin neden olduğu ölümlerde kolon kanseri ikinci sıradadır. Kolorektal kanser görülme sıklığı erkelerde üçüncü sırada iken kadınlarda dördüncü sırada yer almaktadır. Tedavisi için cerrahi yöntem yanında ilaç tedavileri uygulanmakta ve uygun protokoller oluşturulmaya çalışılmaktadır. HAMLET (human α-lactalbumin made lethal to tumor cells) ve Sulindac, bu amaçla kullanılan etken maddelerdendir. HAMLET insan anne sütünden elde edilen Ca+2 bağlayıcı protein α-laktalbumin ve yağ asidinden (oleik asit) oluşan bir maddedir. İn vivo ve in vitro ortamlardaki tümör hücrelerinin yüzeyine tutunarak hücre içersine girer ve nukleusta histon proteinleri ile kromatine bağlanır. Kromatini dönüşümsüz bir hasara uğratır, mitokondriyi hedef alarak kaspazları aktive eder ve böylece apoptozisi indükler. Sulindac ise non-steroidal anti-inflamatuar ilaçlar (NSAIDs) dandır. Büyüme inhibitörü olup pro-apoptotik etkiye sahiptir. Bazı kanser türlerinde (barsak, baş ve boyun) tümör hücrelerinin apoptozise yönelmelerini indükleyerek tedavilerini sağlamaktadır. Apoptozis, memeli hücrelerinde ölüm sinyalinin kaynağına bağlı olarak intrensek ve ekstrensek olmak üzere iki yolla gerçekleştirilir. Ekstrensek yol, apoptozu tetikleyen sinyal moleküllerinin hücre zarında bulunan ilgili reseptörlere bağlanması ile aktive edilirken, intrensek yol hücreden kaynaklanan çok çeşitli sinyaller tarafından (onkogen aktivasyonu, DNA hasarı gibi) tetiklenen bir yoldur ve merkezi rolü mitokondri oynamaktadır. Bu çalışmada COLO-320 Primer ve COLO-741 Metastatik insan kolon karsinomu hücre hatları RPMI-1640, %10 FBS, 2 mM L-glutamin ve %1 penisilinstreptomisin içeren kültür ortamında, 37o C ısı ve %5 CO2 sağlayan inkübatörde kültüre edildi. Hücreler 4' erli gruplara ayrıldı. Her bir hücre hattının 1. gruplarına hiçbir ilaç uygulanmadı ve kontrol grubu olarak kabul edildi. 2. gruplarına α-Laktalbumin, 3. gruplarına Sulindac ve 4. gruplarına α-Laktalbumin+ Sulindac kombinasyonu uygulandı. İlaç etkileri 24., 48. ve 72. saatlerde incelendi. Sitotoksite analizi için, MTT ve laktik dehidrogenaz düzeyi, ultrastrukturel inceleme için elektron mikroskobi tekniği, apoptotik hücre dağılımı için TUNEL yöntemi, kaspaz-3, kaspaz-9 ve sitokromC dağılımları için ise indirekt immunoperoksidaz yöntemi kullanıldı. Elektron mikroskobik inceleme sonrasında, her iki hücre hattının kontrol gruplarında hücre ve çekirdek konturlarının düzgün olduğu, tedavi alan tüm gruplarda apoptotik cisimciklerin gözlendiği, fakat kombine tedavi uygulanan COLO-320 grubundaki hücrelerde apoptotik cisimciklerin daha fazla olduğu saptandı. TUNEL pozitif hücre sayısının tedavi alan grupların hepsinde ve özellikle COLO-320 grubundaki hücrelerde daha fazla olduğu izlendi. Kaspaz-3, kaspaz-9 ve sitokrom-C dağılımlarının tedavi uygulanan gruplarda pozitif olduğu gözlenir iken, özellikle kombine ilaç uygulanan gruplarda her üç immunoreaktivitenin daha fazla olduğu saptandı. Çalışmamız sonucunda α-Laktalbumin ve Sulindac' ın primer ve metastatik insan kolon karsinoma hücre hatlarında apoptotik mekanizmaları tetiklendiği, primer insan kolon karsinoma hücre hattında metastatik hücre hattına oranla daha fazla olduğu tespit edildi. Çalışmanın in vivo çalışmalara öncülük edebileceğini düşünmekteyiz. Anahtar Kelimeler: Kanser, Apoptozis, α-Laktalbumin, Sulindac
3D endometrium benzeri kültür sistemi kullanılarak in vitro implantasyon modelinin geliştirilmesi
Amaç: Hem embriyo hem de kanser hücrelerinin invazyon modelinde kullanılabilecek üç boyutlu (3D) endometrium benzeri kültür sisteminin geliştirilmesi ve bu sisteme invaziv özellikte olan hücrenin ekimi ile epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının araştırılması amaçlanmıştır. İn Vitro üç boyutlu endometrium benzeri kültür sistemi, poröz bakteriyel selüloz (BC), kollajen köpük (COL/K) ve kollajen fiber (COL/F) doku iskeleleri üzerine endometrium epitelyal hücre hattı (RL95-2) ile invaziv sferoid oluşturma özelliği olan trofoblast benzeri koriyokarsinom (JAR) hücre hatlarının tekli ve ikili ekimi sonucunda implantasyon, invazyon basamaklarında görülen epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının araştırılması hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Çalışmada üretilen üç farklı tip doku iskelesi ile ticari olarak satın alınan RL95-2 ve JAR hücreleri kullanılmıştır. Hücreler uygun besiyerlerinde kültüre edilip, %80 konfluent olduktan sonra doku iskeleleri üzerine tekli veya ikili olarak ekilmiştir. Kültürün 3., 5., 7., 10. ve 14. günlerinde iskeleler %4 paraformaldehit ile fikse edilerek frozen kesitleri alınmıştır. Epitelyal belirteç olarak E-kaderin, mezenkimal belirteç olarak N-kaderin, Vimentin, α-SMA ve Syndecan-1 dağılımları indirekt immunoperoksidaz ya da immunofloresan boyama yöntemleri ile analiz edilmiştir. Doku iskelelerinin karakterizasyonu ise SEM yöntemi ile yapılmıştır. Bulgular: RL95-2 hücrelerinde E-kaderin, N-kaderin, Vimentin, α-SMA ve Syndecan-1 immunoreaktivitelerinin JAR hücrelerinden daha fazla olduğu, E-kaderin ve Syndecan-1 dağılımlarının RL95-2 hücresinde, N-kaderin ve Syndecan-1 immunoreaktivitelerinin de JAR hücrelerinde diğer belirteçlere oranla daha fazla olduğu görüldü. Doku iskelelerinin karakterizasyonu sonucunda; BC gözenek büyüklüğü 97 ± 28 µm, COL/K gözenek büyüklüğü 109 ± 21µm ve COL/F doku iskelelerinin çapının ise 0,67 ± 0,14 µm olduğu saptandı. Epitelyal mezenkimal geçiş belirteçlerinin her üç doku iskelesinde de boyandığı, fakat BC' un özellikle metastatik kurulacak modellerde JAR hücrelerinin kullanılmasında, COL/K doku iskelesinde JAR hücrelerinin 7. günde, RL95-2 hücrelerinin ise 14. günde mezenkimal özelliklerinin daha fazla olduğu, COL/F doku iskelesi kültüründe ise, RL95-2 hücrelerinin erken dönem kültürlerinde epitelyal özellikten mezenkimal özelliğe dönmesini desteklediği, RL95-2 ve JAR hücrelerinde E-kaderin, N-kaderin, Vimentin, α-SMA ve Syndecan-1' in kültürün 14. gününde daha fazla olduğu gözlendi. Sonuç ve Yorum: Farklı iskeleler kullanılarak geliştirilen 3D endometrium benzeri kültür sistemi ile hem kanser hücrelerinin invazyonu sırasında hem de embriyo implantasyonu sırasında görülen epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının farklı günlerdeki ifadelerinde değişim saptandığı ve kurulan bu modellerin ileriki araştırmalar için bir ön çalışma niteliğinde olduğu düşünülmüştür.
Deneysel olarak diyabet oluşturulmuş sıçanlarda yara modeli üzerine periferik mononükleer kök hücre ve bunlardan farklandırılmış langerhans hücre uygulamasının iyileşme üzerine etkileri
Deride yara iyileşmesi özellikle kronik ve diyabetik olanlarda maliyetli ve hasta yaşam kalitesini azaltan zor durumlardır. Bu konuda son zamanlarda kök hücre tedavisi giderek artan önem kazanmış ve değişik kaynaklardan elde edilen hücresel ürünler klinik kullanımda tedavide yerini almıştır. Periferik Mononükleer Kök Hücre (PKMH) periferik dolaşımdan kolaylıkla elde edilen ve uygulanabilecek bir KH türüdür. PKMH ile yara iyileşmesinde çok az yayın olup bunlardan farklanan langerhans hücreleri (FLH) ile tedavideki etki bilinmemektedir. Bu çalışmada, PKMH ve FLH deneysel diyabetik greft yara modelinde iyileşmeye etki açısından incelendi ve karşılaştırılarak olası mekanizmalar için değerlendirildi. Alınan kan örneklerinde PKMH izolasyonu, kültürde çoğaltılması ve FLH farklılaştırılması sağlandı. Erişkin Wistar albino sıçanların sırt bölgesi traşlanarak 1x1 cm boyutunda karşılıklı yer değiştirmek suretiyle dört adet tam kat deri grefti yapıldı. Kültür ortamında greftlar üzerine kök hücreler ekilerek yara bölgesine uygulandı. Sıçanlar diyabetli olanlar (DG) beş ve olmayanlar (NDG) beş grup olarak 10 gruba ayrıldı. Kontrol grubuna sadece greft yara modeli yapılacak, sham grubuna sadece besiyeri uygulanacak ve diğer gruplara ise, besiyeri içerisinde PMHK, FLH ve birlikte olacak şekilde greft üzerinde yara bölgesine uygulandı. Hücresel tedavi 7 gün boyunca her bir yaraya 1x106 hücre uygulandı. Sırttaki greftlerden 3. ve 7. günlerde biyopsi ile örnekler incelendi. Histokimyasal (HK) olarak H-E, masson trichrome (MT) ve PAS, immunohistokimyasal (İHK) olarak oksidatif stres için e-NOS ve i-NOS, çoğalma belirteci olarak PCNA, damarlanma belirteci olarak VEGF, inflamasyon belirteci olarak IL-1 ile apoptoz için TUNEL boyaması yapıldı. Mikroskop altında alınan görüntüler dijital ortama aktarılıp imageJ ile morfometrik ve H-skor ile değerlendirilip gruplar arasında farkın istatistiği bulundu. Kültür ortamında deri üzerine ekilen hücrelerin SEM analizi yapıldı. PKMH ve FLH izolasyonu kolay olmasına rağmen çoğalmadıkları gözlendi. Yapılan karakterizasyonlarında KH belirteçlerini pozitif ve negative olarak exprese ettikleri izlendi. Hücrelerin SEM analizinde deri üzerinde kaldıkları ve deri ile etkileşimde oldukları saptandı. Yapılan greft uygulamalarından iyileşmenin hızlı gerçekleştiği ve NDG için 2 ile 4 gün ve DG için ise 4 ve 7 günler arasında yaranın kapandığı izlendi. 3. günde arasında ve HK olarak H-E, masson trichrome (MT) ve PAS boyamalarında DG için daha da belirginleşen ve etkinleşen histopatolojik düzelmeler görüldü. Morfometrik analizde epitel kalınlığı (EK), Fibroblast sayısı (FS), yeni damar oluşumu (YDO), kollajen (KOL), matriks ve fibril dağılımın anlamlı olarak iyileştiği bulundu. İHK olarak yine DG için belirgin ve etkin belirteç değşiklikleri saptandı. Oksidatif stres için e-NOS ve i-NOS, çoğalma belirteci olarak PCNA anlamlı olarak artmadığı, damarlanma belirteci olarak VEGF artışı, inflamasyon belirteci olarak IL-1 azalışları ile apoptoz için TUNEL boyamasında anlamlı azalma izlendi. Mikroskop altında alınan görüntüler dijital ortama aktarılıp imageJ ile morfometrik ve H-skor ile değerlendirildiğinde görüntülerde izlenen değişikliklerin istatiksel olarak anlamlılığı ortaya kondu. KH uygulamasının tek uygulamalarındaki anlamlı katkı ve başarı birlikte uygulamalarında daha da belirginleşti. Daha dengeli, olgun ve komplikasyonsuz yara iyileşmesi oluştu. Kültür ortamında deri üzerine uygulanan bu yeni hücresel tedavinin başarılı ve etkin greftlemesi diyabetik zor yara iyileşmesinde greft etkinliğinin ve başarının arttırılmasını sağlayacağı bulundu. Ileri düzeyde mekanizmalarının araştırılmasının bilime katkı sağlayacağı ve faz çalışmalarında insan klinik uygulamasında maliyetleri azaltarak hasta yaşam kalitesini arttıracağı düşünüldü. Anahtar kelimeler; Diyabet, Greft, Yara Iyileşmesi, Periferik Mononükleer Kök Hücre, Langerhans hücre faklılaşması
Prematüre ovaryan yetmezlik modelinde foliküler atrezi ile granüloza hücrelerinin hücre ölüm mekanizmaları açısından ilişkisinin incelenmesi
Amaç: Prematüre ovaryan yetmezlik (POY) özellikle 40 yaşından önce kadınlarda klinik olarak amenore, yüksek gonadotropin ve düşük östrojen seviyeleri ve ovaryumda gelişen folikül kaybına bağlı ovaryum rezervlerinin erken tükenmesi ile ortaya çıkan önemli bir infetilite nedenidir ve etiyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Ovaryumda oosit ve folikül gelişimine metabolik destek sağlayan granüloza hücrelerinin aşırı kaybı ile tetiklenen foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarının araştırılması yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Son zamanlarda POY etiyolojisinin araştırılmasında kematerapötiklerle indüklenmiş hayvan modelleri kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoteröpatik ajan olan siklofosfamid, ovaryumlara sitotoksik etki yaparak foliküler atreziyi tetiklemektedir. Çalışmamızda, siklofosfamid ile C57BL/6 cinsi dişi farelerde prematüre ovaryan yetmezlik modelinin oluşturulması, alınan kan ve doku örnekleri ile modelin oluşumunun biyokimyasal ve histopatolojik yönden doğrulanması ve foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun immünohistokimyasal yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç Yöntem: C57BL/6 cinsi dişi fareler rastgele kontrol, sham ve POY olmak üzere 3 gruba ayrıldı (n:6, herbir grup için). Prematüre ovaryan yetmezlik modeli siklofosfamid uygulaması ile oluşturuldu. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmadı. POY grubuna siklofosfamid, sham grubuna ise aynı oranda serum fizyolojik uygulandı. Siklofosfamid 3 hafta boyunca her 2 günde 1 intraperitoneal, ilk doz 70 mg/kg, devam eden dozlar 30mg /kg olarak uygulandı. 3 hafta sonunda hormon serum seviyelerinin analizi için tüm gruplardan genel anestezi altında intrakardiyak 3ml kan alındıktan sonra hayvanlar servikal dislokasyonla sakrifiye edilerek ovaryumları alındı ve histolojik takip yöntemleri uygulanarak elde edilen kesitlere histopatolojik değerlendirme için hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Tüm gruplara ait kesitlerde ışık mikroskobu altında folikül sayımı yapıldı. Kanda serum FSH, LH ve östradiol seviyeleri ELİSA yöntemiyle çalışıldı. Hücre ölüm mekanizmaları belirteçlerinden apoptoz için kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9, otofaji için Lamp1 ve MAP LC3β, paraptoz için ise GRP78 ve CHOP primer antikorları ile immünohistokimyasal boyama yapıldı. Apoptotik hücre varlığının tespiti için TUNEL analizi uygulandı. Sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. Bulgular: Kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda serum FSH ve LH seviyelerinde artış gözlenirken östradiol seviyelerinde düşüş saptandı. Gruplardan alınan ovaryum dokularının histopatolojik değerlendirmesinde, kontrol ve sham grubuna oranla POY grubunda ovaryum dokusundaki bozulma, foliküler atrezinin bir belirteci olan gelişen folikül kaybı ve atrezik folikül sayısında belirgin bir artış gözlendi. Folikül sayımı ile kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda gelişen folikül sayısının azaldığı benzer oranda atrezik foliküllerde artış olduğu izlendi. İmmunohistokimyasal boyamalar sonucunda; kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise kaspaz 3 hafif/orta, kaspaz 8 ve kaspaz 9'un orta şiddette; Lamp1 ve MAP LC3β immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise Lamp1 hafif/orta, MAP LC3β orta şiddette; CHOP ve GRP78 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise orta şiddette gözlendi. TUNEL analizi sonucunda, POY grubu ovaryum kesitlerinde kontrol ve sham grubuna göre daha fazla apoptotik hücre tespit edildi. Sonuçlar: Prematüre ovaryan yetmezlik modelinin siklofosfamid uygulaması ile C57BL/6 dişi farelerde başarılı bir şekilde oluşturulduğu biyokimyasal ve histopatolojik olarak doğrulanmıştır. Foliküler atrezi sürecinde görülen hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun varlığı immünohistokimyasal olarak gösterilmiştir. TUNEL analizi ile hastalık grubundaki apoptotik hücre artışı tespit edilmiştir. Bu çalışmada prematüre ovaryan yetmezliğe yol açan foliküler atrezi sürecinde apoptoz ve otofajinin yanı sıra paraptozun da rol aldığının gösterilmesi, yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Anahtar Kelimeler: Prematüre Ovaryan Yetmezlik, Siklofosfamid, Foliküler atrezi, Apoptoz, Otofaji, Paraptoz
Tekrarlanan kök hücre uygulamasının deneysel asherman modeli üzerine etkisi ile implantasyon ve gebelikte görülen sonuçları
Amaç: Çalışmamızda kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin (KİMKH), sıçanlarda meydana getirilen Asherman sendromu modellemesinde oluşan adezyonun ortadan kaldırılması ve blastokistin endometriyuma implantasyonunda ki rolü ile bu süreçte yer alan moleküller üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Asherman modeli kimyasal olarak oluşturularak tedavisi; besiyeri (BY), kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre (KİMKH) ve 48 saatlik besiyeri (Niş) ile sağlanmaya çalışılan dört farklı grup oluşturuldu. Birinci grup (G1); Asherman+ BY, ikinci grup (G2); Asherman + Niş, üçüncü grup (G3); Asherman + KİMKH ve dördüncü grup (G4); Asherman + KİMKH + Niş olarak ayrıldı. Her bir grup kendi içerisinde üç alt gruba ayrılarak, histokimyasal olarak hematoksilen-eozin ve masson trikrom boyamları ile imunohistokmyasal olarak ise TGF-β1, PCNA, eNOS, VEGF, Stro-1, c-Kit, Laminin, Fibronektin, L- Selektin boyamaları yapıldı. Apoptozis için ise TUNEL boyması yapıldı. Bulgular: Grupların hem histolojik hemde yeni doğan sayısına göre morfolojik değerlendirmelerinde KİMKH ve KİMKH + Niş verilen gruplarda diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı fark (p<0,05) saptanmıştır. KİMKH ile Nişinin uterin adezyonlarda yapışıklıkları ortadan kaldırabildiği, endometriyumu implantasyon için daha uygun hale getirdiği saptandı. Sonuçlar: Tedavi gruplarında endometriyal kalınlığın, bez sayısının ve vaskülarizasyonun artması, fibröz alanların azalması, adeziv alanlarda da embryoların implante olması ve yeni doğan sayısının artmış olması deneysel Asherman çalışmlarının kliniğe taşınmabilmesi açısından ümit vericidir. KİMKH ve Niş uygulamalarının, infertiliteye neden olan mekanizmaların içerisinde yer alan adezyon molekülleri üzerinden tedavi ile kliniğe katkı sağlayabileceği gösterildi. Anahtar Sözcükler: Asherman, İmplantasyon, Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre, Histoloji.
Deneysel PKOS modelinde oosit maturasyonunun değerlendirilmesi
PKOS'lu kadınlardan oosit elde edilmesinin zorluğu göz önüne alındığında, deneysel PKOS modeli oluşturulduktan sonra elde edilen oositlerin, maturasyon çalışmalarına olanak sağlaması ve bu çalışmalardan elde edilecek verilerin gelecekte infertilite tedavisine katkı sağlayabilecek olmasından dolayı büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada deneysel PKOS fare modelinde farklı ilaç uygulamalarından sonra oosit maturasyonunu etkileyen faktörlerin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Dört haftalık dişi Balb/C farelerde deneysel PKOS modeli 21 gün boyunca 6 mg/100g DHEA verilerek oluşturuldu. PKOS modeli oluşturulan farelerde sadece klomifen sitrat ya da klomifen sitrat, metformin ve pioglitazon kombine olarak uygulandıktan sonra oosit maturasyonunu etkileyen Cep55, Cdk4, Hsp27, Nobox, Foxl2, Cx37, Cx43, Adamts-1 ve Adamts-9 belirteçlerinin değişimleri hem ovaryumlarda hem de oositlerde immunoperoksidaz ve immunofloresan yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Histolojik ve morfolojik bulgular ile PKOS modelinin geliştiği gösterildi. PKOS grubunda ovaryumlarda özellikle sekonder foliküllerde ve oositlerde oosit maturasyonunu etkileyen belirteçlerin azaldığı, tedavi gruplarından elde edilen ovaryumlarda sekonder ve tersiyer foliküllerde ve oositlerde belirteçlerin ekspresyonlarının arttığı gözlendi. Sadece klomifen sitrat ile tedavi uygulanan grupta ekspresyonların kombine tedavi grubuna göre daha fazla artmış olduğu tespit edildi. PKOS grubunda bu belirteçlerin ekspresyonunun azalması ve tedavi gruplarında artmış olması, karmaşık moleküler mekanizmaya sahip olan oosit maturasyonunda, yeni moleküllerin gösterilmesi açısından önemlidir. Aynı belirteçlerin daha ileri teknikler ile incelenmesi PKOS'lu olgularda bu belirteçlerin oosit maturayonunda kullanılacak yeni moleküller olacağını düşündürmektedir.
Mezenkimal kök hücrelerin kimyasal olarak indüklenmiş endometrial yaşlanma modeli üzerine etkisi
Amaç: Bu çalışmada insan endometrial epitelyal hücre hattında (RL95-2) hidroksiüre (HU) kullanılarak oluşturulmuş kimyasal yaşlanma modeli ile insan mezenkimal kök hücrelerinin (iMKH) ko-kültürü sonrasında, endometrial hücreler üzerindeki yaşlanma belirteçlerindeki değişimin analizi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışma dört grupta yapılmıştır. (i)Kontrol grubu RL95-2, (ii)HU uygulaması ile yaşlandırılan RL95-2, (iii) HU ile yaşlandırılan ve sonrasında iMKH ile ko-kültür edilen RL95-2, (iv)yaşlandırma olmaksızın iMKH ile ko-kültür edilen RL95-2 hücreleri. Kültür süreleri sonunda hücreler X-gal boyaması, p16Ink4a ve Lamin-B1 antikorlarıyla immünositokimya boyaması yapılmıştır. qRT-PCR analiziyle p16Ink4a ve IL-6 mRNA ifade seviyeleri, hücre kültür vasatlarında IL-1α ve IL-6 ELISA analizi ile protein seviyeleri belirlenmiştir. Bulgular: Çalışma sonuçlarına göre; HU ile yaşlandırılan RL95-2 hücrelerinde kontrole kıyasla p16Ink4a ve IL1α ve IL-6 seviyeleri artmış, Lamin-B1 seviyesi azalmış ve X-gal pozitif hücre oranı yükselmiştir. HU sonrası iMKH ile ko-kültür yapılan grupta yaşlandırma grubuna kıyasla ise p16Ink4a, IL1α ve IL-6 seviyeleri azalmış, Lamin-B1 seviyesi artmış ve X-gal pozitif hücre oranı azalmıştır. Sonuç ve Yorum: Bu bulgular doğrultusunda mezenkimal kök hücrelerin endometrial yaşlanma modeli üzerinde, yaşlanma belirteçlerinde azalmaya sebep olurken, aynı zamanda yaşlanmaya bağlı sekretuvar fenotipi de baskılayarak inflamasyonu da engelleyici etkiler gösterdiği söylenebilir. Daha ileri çalışmalar sonrasında ileri yaş infertilite sebeplerinden birisi olan uterus yaşlanması ve buna bağlı olarak gelişen implantasyon problemlerinde yeni hücresel tedavi yaklaşımları geliştirilebilir. Anahtar Kelimeler: Endometrium, Hücresel Yaşlanma, Kök Hücre
2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)'nin aminoglikozid nefrotoksisitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Aminoglikozidler, Gram (-) enfeksiyonların önlenmesinde etkili olan antibiyotikler olarak uzun zamandır bilinmekte ve kullanılmaktadır. Ancak, hızlı ve yüksek antibakteriyel etkinlik, düşük direnç gelişme potansiyeli, Beta laktam antibiyotiklerle sinerjistik etki ve düşük maliyet gibi avantajlarına rağmen, yan etkileri ve özellikle yüksek nefrotoksisite insidansı nedeniyle klinik kullanımları sınırlanmaktadır. Literatürde aminoglikozid nefrotoksisitesinin iyileştirilmesi için birçok farklı ajanın kullanıldığı çalışmalar bulunmasına rağmen 2- APB'nin kullanıldığı bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu deneysel çalışmada aminoglikozid nefrotoksisitesindeki mekanizmalardan olan ROS ve kalsiyum bağımlı apopitotik ve inflamatuar süreçler temel alınarak gentamisin nefrotoksisitesi üzerine TRP kanal modülatörü 2-APB'nin koruyucu etkisinin araştırılması ve elde edilen sonuçların ışık mikroskobik, elektron mikroskobik ve immünohistokimyasal olarak değerlendirilerek gösterilmesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmada 40 adet Wistar sıçan 5 gruba ayrıldı: Grup 1: Kontrol grubu (n=8): Herhangi bir işlem uygulanmadı. Grup 2: DMSO grubu (n=8): 10 gün boyunca günde 1 kez %10 DMSO intraperitoneal (i.p.) uygulandı. Grup 3: 2-APB grubu (n=8): 10 gün boyunca 2 mg/kg i.p. 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB) %10 DMSO içinde çözündürülerek uygulandı. Grup 4: Gentamisin (G) grubu (n=8): 10 gün boyunca 100 mg/kg intramusküler (i.m.) Gentamisin uygulandı. Grup 5: Gentamisin + 2-APB (GA) grubu (n=8): 10 gün boyunca 100 mg/kg dozunda i.m. Gentamisin ve Gentamisinden 30 dakika önce 2 mg/kg i.p. 2-APB uygulandı. Sakrifikasyon işlemi sonrası ratlardan, biyokimyasal değerlendirme için kan numuneleri, ışık, elektron mikroskobik ve immunohistokimyasal değerlendirmeler için böbrek doku örnekleri alındı. Gentamisin verilen sıçanların böbrek dokusunda ışık mikroskobik olarak; glomerüler dejenerasyon, tübüler genişleme, hücre vakuolizasyonu, tübül lümenine hücre deskuamasyonu ve hyalin kast birikimi, lökositik infiltrasyon şeklinde; elektron mikroskobik olarak glomerül bazal membranında yer yer kalınlaşma, tübül hücrelerinde mikrovillus yapısında düzensizleşme, apikal sitoplazmada blebleşme, lipid birikimi, miyelin figür benzeri yapılar, lizozomlarda sayıca artış, mitokondrionda şişme ve krista yapısının bozulması, apopitotik değişimler ve hücreler arası mesafenin genişlemesi şeklinde değişimlerin olduğu görüldü. İmmünohistokimyasal olarak Tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), Interlökin 6 (IL-6) ve kaspaz 3 ekspresyonunun arttığı tespit edildi. Böbrek fonksiyonlarını değerlendirilmesinde kulllanılan kan üre azotu (BUN), kreatinin değerlerinin arttığı, lipid peroksidasyon göstergesi Malondialdehit (MDA)'in arttığı, antioksidan olan Süperoksit dismutaz (SOD)'ın azaldığı dikkati çekti. Gentamisin+ 2-APB tedavisi ile dejenerasyon varlığını sürdürse de şiddeti ve kapladığı alanın azaldığı, glomerül ve tübül yapılarının genel olarak korunduğu görüldü. 2-APB tedavisi ile gentamisin grubuna göre TNF-α, IL-6, kaspaz 3 immünoreaktivitesinin ve BUN, kreatinin, MDA değerlerinin belirgin olarak azaldığı, SOD'un arttığı görüldü. Sonuç olarak, 2-APB'nin; Gentamisinin oluşuracağı böbrek hasarını önlemede, antioksidan, antiapopitotik, antiinflamatuar etki göstererek hasarın önüne geçebileceği kanısına varıldı.
Siklik GMP amp sentaz / interferon genlerinin uyarıcısı yolağının embriyolojik gelişim sürecindeki yeri
Amaç: Sitozolik DNA'yı tanıyarak inflamatuar süreçleri aktive eden cGAS/STING yolağıdır. Fertilizasyonda bu yolağın baskılanması beklenmektedir. Eğer bu yolak baskılanmazsa inflamatuar süreçler aktive olarak fertilizasyon başarısızlığına veya da erken embriyonik gelişimde bozukluğa yol açabilir. Bu çalışmada cGAS/STING yolağının embriyolojik gelişim sürecindeki yerinin belirlenmesi, fertilizasyona ve embriyolojik gelişime etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmada Balb/C cinsi farelerden üç grup oluşturulmuştur. Grup 1: Kontrol grubu, Grup 2: Fertilizasyon grubu (Çiftleştirildikten sonra embriyonik 1. gün sakrifiye edilen grup; n:15), Grup 3: İmplantasyon grubu (Çiftleştirildikten sonra embriyonik 4,5. gün sakrifiye edilen grup; n:15). Grup 1 ve Grup 3' de Hematoksilen ve Eozin ile cGAS, STING, NLRP14, IRF3 ve IFN primer antikorları ile indirekt immunohistokimya metodu uygulanmıştır. Grup 2'de ise 1 günlük embriyolar toplanıp, immunflorasan boyama yapılmıştır. Bulgular: Kontrol grubunda, cGAS/STING yolağının ve bu yolağın negatif regülatörü NLRP14'ün varlığı indirekt immunohistokimya ile gösterilmiştir. Fertilizasyondan sonra 1 ve 4,5. günlerdeki embriyolarda yüksek cGAS ve STING immunoreaktiviteleri ile orta düzeyde IRF3 ve IFN immunoreaktiviteleri, negatif NLRP14 immunoreaktivitesi saptanmıştır. Sonuç ve Yorum: Kontrol grubu, embriyonik 1 ve 4,5. günlerdeki cGAS/STING yolağına ait moleküllerin ve bu yolağın negatif düzenleyicisi olan NLRP14'ün immunoreaktivite düzeyleri saptanmıştır. Özellikle NLRP14'ün fertilizasyon ve erken embriyo gelişiminde nükleik asit algılayıcı yolağın suprese edilmesinde önemli olduğu ve açıklanamayan infertilite olgularında göz önüne alınması gerektiği öne çıkmaktadır. Anahtar Kelimeler: cGAS, STING, NLRP14, fertilizasyon, implantasyon, ovaryum, testis
Azospermi oluşturulan farelerde testis hasarının serum mikroRNA düzeyi ile belirlenmesi
AMAÇ: Siklofosfamid (CP) alkilleyici, kemoterapötik ajandır. Kanser tedavilerinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve birçok organ üzerinde özellikle gonadlar üzerinde zararlı etkileri bulunmaktadır. Bu çalışmada, farelerde CP uygulaması sonrasında ortaya çıkan testis hasarının, GDNF, Okludin ve TGF-β3 primer antikorları ile immunohistokimyasal teknik kullanılarak belirlenerek, kan ve doku örneklerindeki mir-34b ve mir-34c arasındaki ilişkinin tespit edilmesi amaçlandı. GEREÇ VE YÖNTEM: Manisa Celal Bayar Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma ve Uygulama Merkezi Laboratuvarları'ndan alınan sağlıklı 2 aylık erkek fareler (n:18) üç gruba ayrıldı. Kontrol grubuna hiçbir işlem uygulanmadı. Deney grubuna 5 gün boyunca intraperitoneal, günde bir kez 100 mg/ kg CP, sham grubuna ise aynı miktarda serum fizyolojik enjekte edildi. Son enjeksiyondan 24 saat sonra hayvanlar sakrifiye edilerek, testis dokuları ve kan örnekleri alındı. Dokular ve kan örnekleri immunohistokimyasal ve RT-PCR incelemeleri için takip edildi. BULGULAR: Testis dokularının immunohistokimyasal incelenmesinde, kontrol grubu ve sham grubu ile karşılaştırıldığında, CP verilen grupta spermatogenik germ hücre sayısında, GDNF ve Okludin ekspresyonlarında azalma; TGF-β3'ekspresyonunda artış gözlendi. RT-PCR tekniği ile mir-34b ve mir-34c ekspresyonları incelendiğinde, doku örneklerinde CP verilen grupta belirgin azalma tespit edilirken, plazma örneklerinde yeterli ekspresyon gözlenmedi. SONUÇLAR: Bu çalışmada, CP'nin neden olduğu testis hasarında GDNF, Okludin ve TGF-β3 ekspresyonlarının önemli rol oynadığı, doku örneklerinde mir-34b ve mir-34c ekspresyonlarında ortaya çıkan azalmanın, testis hasarının belirlenmesinde önemli bir marker olabileceği, ancak plazmada tespit edilebilmesi için daha ileri tetkiklere ihtiyaç olduğu sonucuna varıldı. ANAHTAR KELİMELER: Siklofosfamid, testis, GDNF, Okludin, TGF-β3, miR34b/c
Derin öğrenme ile histopatolojik olarak tanı konmuş 65 yaş üstü metastatik meme kanseri hastalarında kemoterapi yan etkisini öngörme
Bu çalışmada, Histopatolojik olarak tanı konmuş 65 yaş üstü meme kanseri hastalarının tedavi edilme aşamasında makine öğrenmesi ve derin öğrenme yöntemlerinden faydalanılarak, kemoterapi yan etkilerini önceden tahminlemeye yönelik analiz çalışması yapılması hedeflenmektedir. Yapılan çalışma ile, hastaya kemoterapi verilip verilmemesi konusunda hekimlere fikir verilmesi hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Google tarafından geliştirilen ve açık kaynak kodlu bir kütüphane olan TensorFlow kütüphanesi kullanılacak olup bünyesinde birçok derin öğrenme algoritmasını barındıran kütüphane, ptyhon dili kullanılarak geliştirilmiştir. Kütüphane 1000'den fazla yazılımcı tarafından geliştirilmektedir. Derin öğrenme yöntemlerindeki başarı seçilecek veri özellik kümesinin belirlenmesine bağlıdır, bu çalışma için kanserli hastalara uygulanan kemoterapi tedavisinde en çok bakılan özelliklerden ve kemoterapi sonucunda ortaya çıkan yan etkilerden oluşan bir veri kümesi seçilmiştir. Geliştirilen sistem üzerinde öncelikle hastalara ait ilgili bilgiler girilmiş, ardından bu hastalarda kemoterapi tedavisinin sonuçları belirtilmiştir. Bu işlem sonucunda Makine öğrenmesi yöntemleri kullanılarak ilgili veri kümesi öğrenme işlemine tabi tutulmuş, bu işlem sonucunda yeni bir hasta geldiğinde bu hasta için kemoterapi uygulanıp uygulanmayacağı sistem tarafından tahmin edilmeye çalışılmıştır. Bulgular: Derin öğrenme modeli için yeterli veri olduğunda derin öğrenme yaklaşımlarının klinik karar verme süreci ve tedavi yaklaşımlarına başarıyla uygulanabileceği, uygun, doğru ve yeterli veri seti uygulandığında daha başarılı sonuçlar elde edileceği ve başarı oranının %90'lara ulaşacağı görülmüştür. Sonuçlar: Meme kanseri tanısında, derin öğrenme tekniklerinin kullanılması ile teşhis yöntemin doğruluğu ve uygun tedavi yöntemi arttırılabilir. Bu çalışma ile sunulan sonuçların derin öğrenme tekniğin diğer hastalıkların teşhis ve tedavisi için de daha ileri araştırmalara yol açacağı düşünülmektedir.
Salubrinalin in vitro ısı stresi oluşturulmuş spermatogenik hücrelerde er stres yolağı üzerine etkisi
Amaç: Deneysel olarak in vitro ısı stresi modeli (ISM) oluşturulmuş Spermatogenik hücrelerde Salubrinalin (SAL) endoplazmik retikulum (ER) stresi üzerinde etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmada fare spermatogonyum (GC1) ve fare spermatosit (GC2) hücre hatları kullanıldı. SAL'ın IC50 dozu MTT yöntemi ile hesaplandı. Her bir hücre kontrol grubu (GC1-K, GC2-K), SAL grubu (GC1-SAL, GC2-SAL), ISM grubu (GC1-ISM, GC2-ISM) ve hem ISM hem SAL grubu (GC1-ISMSAL, GC2-ISMSAL) olmak üzere 4 alt gruba ayrıldı. Kontrol grubu hücreler standart kültür koşullarında inkübe edildi. ISM oluşturulan gruplar 430C sıcaklıkta 60 dk. inkübe edildi. SAL uygulaması yapılan gruplarda 20 µM SAL içeren besiyerinde 24 saat inkübasyon gerçekleştirildi. Deney sonrasında tüm gruplarda p-PERK, ATF6, GRP78, p-IRE1α, p-eIF2α, HSP70 belirteçleri ile immünfloresan boyama analizi yapıldı. Ayrıca tüm deney gruplarında GRP78, PERK ve eIF2α mRNA seviyeleri qRT- PCR yöntemi ile ölçüldü. Bulgular: ISM modelinin hücreler üzerinde sitotoksik etkiye sahip olduğu görüldü. ISM oluşturulmuş gruplarda tüm belirteçlerin immünoreaktivitelerinin artmış olduğu, bu hücrelerde ER stresi meydana geldiğinin bir göstergesi olarak kabul edildi. SAL uygulamasının ER stresini azaltmış olduğu tespit edildi. GRP78, PERK ve eIF2α mRNA seviyelerinin ISM uygulanan gruplarda artmış olduğu bulundu. SAL uygulanan gruplarda mRNA seviyelerinde azalma olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı. Sonuçlar: Bu bulgular ışığında, spermatogenik hücrelerde ısı stresinin, ER stresini tetiklediği ve SAL'ın bu stres belirteçleri üzerinde etkin olduğu düşünüldü. Yapılacak ileri moleküler analizlerle spermatogenik hücrelerde ısı stresinde ER kaynaklı stres mekanizmalarının araştırılması teröpatik stratejiler açısından önem kazanacaktır.
Farklı deneysel prematür over yetmezliği modellerinde kök hücre tedavisinin etkinliği
Amaç: Sıçanlarda siklofosfamid (CYP) ve 4-vinilsiklodiepoksid hekzen (VCD) ile oluşturulmuş Prematür Over Yetmezlik (POY) modelinde, POY etiyolojisinde etkili olduğu düşünülen bazı moleküllere Yağ Doku Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin (YDMKH) ve NİŞ ortamının etkilerinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: 8 haftalık Wistar Albino cinsi sıçan 8 gruba bölündü. 21 adet sıçana 120mg/kg CYP 1 hafta arayla 2 doz verilerek, 21 adet sıçana ise 5 gün boyunca 240mg/kg VCD verilerek POY indüklendi. YDMKH gruplarında deneyin 15. gününden itibaren 3 gün art arda 1x106 hücre enjeksiyonu i.p olarak yapıldı. NİŞ grupları içinse POY oluşturulan farelere deneyin 15. gününden itibaren 3 gün art arda 0,1ml NİŞ enjeksiyonu i.p olarak yapıldı. Ovaryumda histopatolojik değerlendirmeler için H&E ve Masson Trikrom boyamaları yapıldı ve tüm ovaryum folilkülleri sayıldı. ELİSA yöntemi ile serum AMH seviyesi ölçüldü. Daha sonra iNOS, Casp3, Cx43, Panx1 protein ve mRNA ekspresyon seviyeleri immunohisyokimya ve qPCR yöntemleri ile analiz edildi. Bulgular: Her iki POY modelinde ovaryumda farklı miktarlarda hemoroji, vakuolizasyon, fibrozis gibi dejenerasyonlar gözlendi. POY gruplarında iNOS, Casp3, Panx1 ekspresyonları artarken, Cx43 ekpresyonu azaldı. YDMKH ve NİŞ uygulamasında ise bu moleküllerin ekspresyonları kontrole yakın bulundu. Sonuçlar: Hem VCD hem de CYP deneysel POY modeli oluşturmak için uygun ajanlar olarak belirlendi. VCD daha çok primordiyal ve primer foliküllerde dejenerasyonlara sebep olurken, CYP gelişmekte olan folikülleri etkiledi. Bahsedilen moleküllerin POY oluşumunda önemli moleküller olduğu ve bu moleküllerin hastalığın mekanizmasını aydınlatmada etkili olacağı düşünülmektedir. Her iki grupta da YDMKH ve NİŞ'in iyileştirici etkileri POY'un tedavisine yönelik yeni yöntemlerin gelişmesine katkı sağlayacağını göstermektedir.
Deneysel OHSS modelinde kisspeptin-54 uygulamasının granüloza hücrelerindeki VEGF ve PEDF seviyelerine etkisi
Amaç: OHSS modeli oluşturulmuş sıçanlarda, Kisspeptin-54'ün, ovaryum morfolojisine ve VEGF, PEDF, PKA ve PKC seviyelerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: İmmatür dişi Sprague-dawley sıçanları (n=30, 25 günlük, 30-40gr) rastgele 5 gruba (kontrol, sham, OHSS modeli, kısa süreli kisspeptin-54 uygulanmış OHSS modeli ve uzun süreli kisspeptin-54 uygulanmış OHSS modeli) ayrıldı. Serum LH ve FSH seviyeleri ELISA ile belirlendi. Sağ ovaryumlardan oositler ve granüloza hücreleri izole edilerek VEGF, PEDF, PKA, PKC için qRT-PCR analizi yapıldı. Oositler alfa-tübülin için immünofloresan yöntem ile boyandı. Sol ovaryum dokuları morfolojik olarak ve VEGF, PEDF, PKA, PKC için immünohistokimyasal yöntemler ile değerlendirildi. Bulgular: OHSS grubunda, fallop tüplerinde dilatasyon, ovaryumlarda anormal ağırlık ve hacim artışı gözlendi. Kısa ve uzun süreli Kisspeptin-54 uygulanan gruplarda etkilerin azaldığı belirlendi. OHSS grubunda, gelişmekte olan foliküllerin ve korpus luteumların azaldığı, kistik ve atretik foliküllerin arttığı gözlenirken, Kisspeptin-54 uygulanan gruplarda, gelişen folikül sayılarının ve korpus luteumun arttığı, atretik ve kistik foliküllerin azaldığı saptandı. OHSS grubundaki granüloza hücrelerinde VEGF, PKA, PKC seviyeleri mRNA ve protein düzeyinde artış gösterirken, PEDF seviyelerinin düştüğü belirlendi. Kisspeptin-54 uygulanan gruplarda bu etkilerin iyileştiği bulundu. Oositlerin tüm gruplarda immatür olduğu, olgun oositlerin kesimden önce ovulasyona uğradığı gözlendi. Uzun tedavi protokolünün kısa tedavi protokolünden daha etkili olduğu belirlendi. Sonuçlar: Kisspeptin-54'ün OHSS bulgularını azaltan etkilere sahip olduğu belirlendi. Kisspeptin-54'ün OHSS riskli kadınlarda oosit matürasyonunu tetikleyebilen bir aracı olduğu düşünülmektedir.
Fare endometriyumundan geliştirilen organoidde implantasyon potansiyeli
Bu çalışmada fareden endometrial organoid oluşturulması, oluşturulan endometrial organoide blastokistlerin implantasyon potansiyelinin incelenmesi ve insan kökenli mezenkimal kök hücrelerin hem organoid oluşumu hemde implantasyon başarısındaki yerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla östrus dönemindeki 6-8 haftalık Balb-c dişi fareler kullanıldı. Eş zamanlı olarak östrus dönemindeki 3 adet dişi farelerden embriyonik 3,5. günde toplanan blastokistler çalışma gruplarına göre eklenerek kültüre edildi. Çalışma grupları; proliferasyon evresindeki endometrial organoid kültürü (grup 1), proliferasyon evresindeki endometrial organoid + iMKH ile 48 saat indirekt ko-kültürü (grup 2), sekresyon evresindeki endometrial organoid kültürü (grup 3a), sekresyon evresindeki endometrial organoid +blaskosit kültürü (grup 3b), sekresyon evresindeki endometrial organoid + iMKH 48 saat indirekt ko-kültürü (grup 4a) ve sekresyon evresindeki endometrial organoid + iMKH 48 saat indirekt ko-kültürü+ blastokist kültürü (grup 4b) şeklinde oluşturuldu. Çalışma sonrasında model histokimyasal analiz için hematoksilen-eozin boyaması ile immunohistokimyasal analiz için LIFR, pan-sitokeratin, müsin 1, MMP9 ve CD146 dağılımları image j analiz yöntemi ile değerlendirildi. Çalışma gruplarına göre Hematoksilen-Eozin ile boyanmasında bez ve epitel yapıları açıkça görüldü. Yapılan indirekt immunohistokimya boyamasında çalışma gruplarına göre incelenen protein immünoreaktivitelerinin normal endometriyum dokusunu yansıtacak düzeyde farklılıkların olduğu görüldü.Çalışmada uygulanan protokol ve kullanılan faktörler ile proliferasyon-sekretuar dönemdeki, iMKH ve blastokist ilave edilen gruplardaki farklılıkların anlamlı olmasıyla in vitro endometrial organoid modelin oluşturulabildiği sonucuna varıldı.
İnsan adipoz kökenli mezenşimal kök hücre kaynaklı eksozom ve nanoveziküllerin, insan (HGRC1) ve sıçan (SIGC) granüloza hücre hatlarında siklofosfamid ile oluşturulan hasar üzerine koruyucu etkisinin incelenmesi
Amaç: Bu çalışmada, in vitro şartlarda hem insan (HGrC1) hem de sıçan (SIGC) granüloza hücre hatlarında 4-hidroperoksi siklofosfamit (4-HC) ile apoptoz indüklenerek ADMSC'lerden elde edilen eksozom (EXO) ve nanoveziküllerin (NV) antiapoptotik ve terapötik etkilerinin incelenmesi amaçlanmaktadır. Gereç ve Yöntem: ADMSC'lerden EXO ve NV'ler izole edilerek karakterizasyonları flow sitometri yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. EXO ve NV'ler, HGrC1 ve SIGC hücre hatları ile hem tek başlarına hem de 4-HC ile birlikte kokültüre edilerek hücre canlılığı MTT yöntemi kullanılarak tespit edildi. Tüm uygulamalar sonrası apoptoz (Kaspaz 3, Bax ve Bcl-2) ve hücre proliferasyon (Ki-67) belirteçlerinin hem protein hem de mRNA ifade seviyeleri indirekt immunositokimya ve qRT-PCR yöntemleri ile analiz edildi. Ayrıca tüm gruplardaki hücre döngüsü analizleri flow sitometri yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Bulgular: ADMSC EXO ve NV'lerinin tek başlarına HGrC1 ve SIGC hücre hatları ile kokültüre edilmesi sonrası granüloza hücre proliferasyonlarını indükledikleri saptandı. Her iki hücre hattında da 4-HC grubuna kıyasla 4-HC ile birlikte EXO ve NV ile kokültüre edilen gruplardaki Kaspaz 3 ve Bax ifadelerinin azaldığı Bcl-2 ve Ki-67 ifadelerinin ise arttığı tespit edildi. Buna ek olarak EXO ve NV'ler ile kokültüre edilen gruplarda S fazında tutulan hücre yüzdelerinin azaldığı, G2/M fazındaki hücre yüzdelerinin ise arttığı gözlendi. Sonuçlar: EXO ve NV'lerin, her iki granüloza hücre hattı üzerinde de sitostatik veya sitotoksik etkilerinin olmadığı, 4-HC'nin apoptotik etkisine karşı koruyucu kapasitelerinin olduğu ve bununla birlikte granüloza hücre proliferasyonunu indükledikleri gözlendi. Bu çalışma ile literatürde ilk defa ADMSC'lerden yapay olarak elde edilen NV'lerin, EXO'lar gibi benzer terapötik etkinliklerinin olduğu gösterildi. Bu sonuçlar, EXO ve NV'lerin, POI'nin önlenmesi ve tedavisinde etkili ve yeni bir yöntem olabileceğini düşündürmektedir.
Karbon tetraklorür ile hepatotoksisite oluşturulmuş sıçanlarda Quercetin'in koruyucu etkilerinin ışık ve elektron mikroskobik düzeyde incelenmesi
Hepatotoksisite birçok farmakolojik ve kimyasal maddenin solunması, ağızdan alınması veya damar içine uygulanmasıyla gelişebilen karaciğer hasarıdır. Karaciğer hasarı sonucunda karaciğer fonksiyonları bozulmakta ve hayat kalitesini önemli ölçüde bozan, hatta ölüme neden olan karaciğer yetmezliği gelişebilmektedir. Karaciğer hastalıklarının tedavisi nedene yönelik olarak yapılmaktadır. Hepatotoksisitede toksik madde kesilerek destek tedavisi uygulanmaktadır. İleri derece hasarda karaciğer transplantasyonu gerekebilir. Günümüzde, karaciğer hasarını önlemeye yönelik çalışmalarda, bitkisel kökenli doğal antioksidanların kullanımı da giderek artan önem kazanmaktadır. Bitkisel kökenli bir antioksidan olan Quercetin birçok bitkinin kabuğunda bulunan kimyasal bir pigmenttir. Bu çalışmada, CCl4 ile karaciğer hasarı oluşturulacak deneysel hayvan modelinde Quercetin'in etkilerinin ışık ve elektron mikroskobik düzeyde araştırılması amaçlanmıştır. Araştırmada 40 adet yetişkin Wistar erkek sıçan 5 gruba ayrılacaktır (n=8). 1. Gruptaki (Kontrol grubu) sıçanlara 14 gün boyunca 0.1 ml saline i.p. olarak uygulanıp, 14. gün 1 ml/kg olive oil tek doz i.p. olarak enjekte edilecek. 2. Gruptaki sıçanlara (Quercetin kontrol grubu) 14 gün boyunca 10 mg/kg Quercetin (0.1 ml salinde çözdürülerek) i.p. olarak uygulanıp, 14. gün 1 ml/kg olive oil tek doz i.p. olarak enjekte edilecek. 3. Gruptaki sıçanlara (CCl4 grubu) 14 gün boyunca 0.1 ml saline i.p. olarak uygulanıp, 14. günde tek doz CCl4 (%50 oranında olive oilde çözdürülerek) 1 ml/kg i.p. olarak enjekte edilecek. 4. Gruptaki sıçanlara (Quercetin ile koruyucu grup) 14 gün boyunca 10 mg/kg Quercetin (0.1 ml salinde çözdürülerek) i.p. olarak uygulanıp, 14. günde tek doz CCl4 (%50 oranında olive oilde çözdürülerek) 1 ml/kg i.p. olarak enjekte edilecek. 5. Grup sıçanlara (Quercetin ile koruyucu ve tedavi grup) 14 gün boyunca 10 mg/kg Quercetin (0.1 ml salinde çözdürülerek) i.p. olarak uygulancak, 14. günde tek doz CCl4 (%50 oranında olive oil'de çözdürülerek) 1 ml/kg i.p. olarak uygulanıp, 14. günden sonraki 4 gün boyunca da 10 mg/kg Quercetin (0.1 ml salinde çözdürülerek) i.p. olarak enjekte edilecek. İlk dört gruptan 15. gün (CCl4 enjeksiyonundan 24 saat sonra), beşinci gruptan ise 19. gün intrakardiyak kan örneği ve karaciğer dokuları alınacaktır. İntrakardiyak kan örneğinde biyokimyasal olarak ALT, AST, TAS, TOS değerleri ölçülecek ve oksidatif stres indeksi hesaplanacaktır. Her denekten alınan karaciğer dokuları ışık mikroskobik ve elektron mikroskobik inceleme için doku hazırlama tekniklerine uygun olarak hazırlanacaktır. Quercetin'in karaciğer histopatolojisi ve karaciğer fonksiyonları üzerine olan koruyucu etkileri incelenecektir. Elde edilecek sonuçlar klinikte hepatotoksisite tedavisine katkı sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler: Karaciğer, karbon tetraklorür, oksidatif stres, Quercetin, transmisyon elektron mikroskobu.
Yüksek glikozlu besiyeri ile deneysel diyabetik modelde hasara uğratılmış spermlere dondurma – çözme işlemi sonrası kök hücre ve niş etkisi
Amaç: Sperm dondurma işlemi, spermlerin kriyoprotektanlar ile -80 -196 °C sıcaklık arasında dondurularak ihtiyaç duyulduğunda tekrar kullanılması amacıyla saklanması işlemidir. Diyabetes Mellitus insülin hormonu eksikliği ya da etkisizliğidir. Yüksek kan şeker düzeyinden dolayı DM hastalarında tüm hücreler oksidatif stres altındadır ve DM nin oluşturduğu hücre hasarından dolayı sperm kalitesi düşmektedir. Kök hücreler organizmanın kendi bünyesinde bulundurduğu kolayca elde edilen ve faktörler aracılığı ile yönlendirilen öncül hücrelerdir. Çalışmalarda kök hücrelerin diğer hücreleri olumlu yönde etkiledikleri bilinmektedir. Çalışmamızda kök hücre ve çevresinin krioprezervasyonun olumsuz etkisi ve diabetin olumsuz etkisi üzerine etkisi değerlendirilerek literetürdeki eksiklik giderilecektir. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda Mezenşimal kök hücre otolog olarak, Sperm hayvanın epididimisin mekanik ayrışma yöntemiyle, hazırlanmış olup deney grupları kök hücre, niş ve kök hücre + niş olacak şekilde diabet taklit grubu ve normal glikoz şeklinde gruplar hazırlandı. Bulgular: Tüm deney gruplarında krioprezervasyon ve zaman apoptatik etkiyi ve oksidatif sitresi artırdığı, diabet taklit gruplarında bu olumsuz etkilerin çok daha arttığı, fakat kök hücre niş ve kökhücre + niş olan gruplarda oksidatif sitres ros düzeylerinin ve canlılık hareket değerlerinde yapılan analizde iyileşme olduğu (p<0,01) gözlendi. Sonuçlar: Çalışmamız sonuçta bulgular ile yapılan değerlendirmede; Dondurma çözmenin sperm hasarını artırdı, Diabet in bu hasarları dahada artırdığı, Mezenşimal kök hücre ve niş uygulamarının bu hasarları azaltığı gözlendi.
Over foliküler atrezide FSH uygulamasının granüloza hücreleri mitokondrionları üzerinden etkisinin incelenmesi
Özet: Folikülogenez, primordial germ hücrelerinde başlar ve matür folikül gelişimine kadar devam eder. Sonucunda olgun oosit ortaya çıkmaktadır. Primordial folikül sayısı, erken embriyonik dönemde fazladır fakat puberteye kadar azalır ve her siklusta yaklaşık 1000 folikül kaybı menopozla birlikte sona ermektedir. Overdeki foliküllerin %99'unun atreziye uğradığı ve granüloza hücrelerinin foliküler atrezide rol oynadığı bilinmektedir. Granüloza hücrelerinde oluşan oksidatif stresin atreziyi başlatıcı etkisi olduğu ileri sürülmektedir. Folikül gelişimi, hormonal ve çevresel uyarıların kontrolü altında gerçekleşmektedir. Aşırı Folikül Uyarıcı Hormon (FSH) kullanımının foliküler gelişimi bozduğu ileri sürülmektedir. FSH'ın, phospho-mTOR (p-mTOR) yolağı ekspresyonunu aktive ettiği, uygulamadan 1,5 saat sonra mikrotübülle ilişkili protein 1A/1B hafif zincir 3 (LC3-I) akumulasyonunu ve 3 saat sonra p-mTOR yolağını inhibe ederek otofajiyi arttırdığı da bilinmektedir. Voltaj bağımlı anyon seçici kanal proteini 2 (VDAC2); apoptoz ile ilişkilidir. VDAC2'nin dominant folliküllerde varlığı gösterilmiş, folikülleri apoptozdan koruyarak folikülün devamlılığını sağlamaktadır. Sirtuin-6 (SIRT6); preantal folikül gelişiminin inbibe edilmesi, foliküllerin gelişimini uzattığı ve ovaryan yaşlanmayı azalttığı bilinmektedir. Gereç ve Yöntem: Fareler rastgele her grupta 6 fare olacak şekilde 4 gruba ayrıldı. Farelerin ötenazileri yapıldıktan sonra overleri toplandı. Ovaryumlar immunohistokimyasal ve qPCR ile incelemek için kullanıldı ve istatistiksel olarak değerlendirildi. Bulgular: Hematoksilen eozin boyama sonucu ovarum dokusu ve foliküller saptandı. Folikül sayımı ile doz artışına bağlı sağlıklı ve atretik folikül sayısı tespit edildi. Otofajik ve mitokondral ilişkili markerlar ile atretik foliküller PCR ile desteklenerek tespit edildi. Sonuç: Çalışmada In Vitro Fertilizasyon (IVF) tedavilerinde yaygın olarak yüksek dozda kullanılan gonadotropinlerin over atreziye neden olup olmadığı; otofajik markerlar olan LC3B ve SIRT6, mitokondrial ilişkisi ise VDAC2 ile immunohistokimyasal ve moleküler olarak incelendi.
FSH'nın fare granüloza hücrelerine etkisinin hippo sinyal yolağı proteinleri (YAP, TEAD ve p73) ve mikroRNA'ları (miR129-5p ve miR145-5p) ile değerlendirilmesi
Rekombinant gonadotropinler aynı anda birden fazla folikülün gelişiminin uyarılması için yardımlı üreme tekniklerinde yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Ancak FSH'nın (folikül stimülan hormon) aşırı kullanımının folikül gelişimini bozduğuna dair çalışmalar mevcuttur. Hormonlar, büyüme faktörleri ve miRNA'lar overdeki hücre proliferasyonunu ve homeostazisi Hippo yolağı aracılığıyla düzenlemektedirler. Bu yolağın üyelerinden YAP/TEAD hücrelerin hayatta kalması ve proliferasyonu yönünde etki ederken; YAP/p73 apoptoza gidişi kontrol eder. Bu çalışmada YAP1/TEAD3 immunreaktivitesi ve bununla ilişkili miR-129-5p ve p73 immunreaktivitesi ve bununla ilişkili miR-145-5p düzeyleri incelenmiştir. Doğrulama amacıyla kaspaz-3 ve bax immunreaktiviteleri değerlendirilmiştir. Yüksek doz FSH uygulamasının granüloza hücreleri üzerindeki etkisinin Hippo sinyal yolağı üzerinden değerlendirilmesi ve bahsi geçen miRNA'lar ile ilişkisinin açıklanması amaçlanmıştır. Balb/c cinsi, 18 adet, 6-8 haftalık dişi fareler kontrol, sham ve deney grubu olarak üçe ayrılmıştır. Deney grubuna her 12 saatte bir sırasıyla 10-10-5-5 IU/ml olmak üzere toplam 4 doz FSH intraperitoneal olarak uygulanmıştır. Sham grubuna deney grubuna verilen FSH hacmine eşit miktarda eş zamanlı olarak %0.09 SF yapılmıştır. Fareler son enjeksiyondan 12 sa. sonra sakrifiye edilmiştir. Over dokuları ve kan örnekleri alınarak RT-PCR ve immunohistokimya teknikleriyle analiz edilmiştir. Over doku kesitlerinin immunohistokimya ile analizinde, granüloza hücrelerinde YAP1 ve TEAD3 immunreaaktivitesi artarken p73 ve kaspaz-3 immunreaktivitelerinde değişiklik gözlenmedi. Gruplar arasında Bax immunreaktivitesinde anlamlı farklılık yoktu. MiR-129-5p ve miR-145-5p, FSH uygulaması sonrası downregüle oldu. P73, Kaspaz3 ve Bax'ın granüloza hücrelerinde değişmeyen immunreaktivitesi yüksek doz FSH sonrası atreziye gidiş olmadığını göstermektedir. YAP1 ve TEAD3 immunreaktivitesinde artış ile miR-129-5p ve miR-145-5p düzeylerinde görülen azalma overde proliferatif sürecin baskın olduğunu ve yüksek doz FSH'ın bu etkiyi Hippo sinyal yolağı üzerinden açığa çıkarttığını göstermektedir.
Deneysel pulmoner fibroziste MiR-26b ve MiR-27b ekspresyonları ile quercetin'in fibrozis üzerine etkisinin araştırılması
Amaç: Kronik, ilerleyici bir hastalık olan İdiyopatik Pulmoner Fibrozis (İPF) alveol duvarında yıkım, miyofibroblast hiperplazisi, hücre dışı matriks birikimi ve akciğer interstisyumunun yeniden şekillenmesi ile karakterizedir. Patogenezi tam olarak aydınlatılamamakla birlikte alveoler epitelyal hücre hasarı ve anormal onarım pulmoner fibrozise yol açan ana mekanizmalardır. Günümüzde İPF'de etkinliği kanıtlanmamış, sınırlı sayıda tedavi seçeneği bulunmaktadır. Çeşitli bitkilerde bulunan bir flavonoid olan Quercetin'in güçlü antioksidan özelliği sayesinde serbest radikallerin yol açtığı hücre hasarını önlediği araştırmacılar tarafından kaydedilmiş olup Bleomisin ile indüklenen pulmoner fibrozisi hafiflettiğini bildiren çalışmalar da bulunmaktadır. Son zamanlarda birçok çalışmada miRNA'ların organ gelişiminde, normal fizyolojide ve çeşitli hastalıkların patogenezinde etkili olduğu ve İPF'de de önemli rol oynadığı rapor edilmiştir. Bu çalışmalar sonucu miR-27b fibroblast aktivasyonunu inhibe eden bir anti-fibrotik miRNA olarak belirlenmiş olmakla birlikte benzer fibrozis modellerinin uygulandığı farklı organlarda miR-26b ekspresyonlarının gösterildiği ancak pulmoner fibrozisteki rolünün yeterince bilinmediği görülmüştür. Çalışmamızda Bleomisin'le oluşturulmuş pulmoner fibroziste miR-26b ekspresyonunun ilk kez gösterilerek hastalığın patogenezindeki rolünün ortaya konulması, Quercetin'in tedavi edici etkilerinin ışık ve elektron mikroskobik yöntemlerle incelenerek miR-26b ve miR-27b'nin ekspresyon düzeyleri ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada 48 adet Wistar sıçan rastgele dağıtılarak başlangıçta 4 deney grubu oluşturuldu. 3. ve 4. gruplar uygulanan tedavi ve yaşam süresine göre daha sonra tekrar 2 alt gruba ayrıldı (n=8). 1. grupta (kontrol grubu) deneyin 0. gününde % 10'luk serum fizyolojik (SF) intratrakeal olarak verildi. 8. gününden başlanarak 21 gün süresince SF intraperitoneal (i.p.) olarak uygulandı. 2.grupta (Quercetin kontrol grubu) deneyin 8. gününden başlanarak 21 gün süresince 50 mg/kg dozunda Quercetin i.p. olarak verildi. 3. Grupta (Hasar grubu) deneyin 0. gününde 10 mg/kg dozunda Bleomisin Sülfat intratrakeal tek doz verildi. Bu hayvanlar 2 alt gruba ayrılarak; yarısı 22. günde (Grup 3A) kalan yarısı (Grup 3B) ise 29. günde sakrifiye edildi. 4. grupta (Tedavi grubu) deneyin 0. gününde 10 mg/kg dozunda Bleomisin Sülfat intratrakeal tek doz verildi. Bu hayvanlar 2 alt gruba ayrılarak; yarısına (Grup 4A) 8. günden başlanarak 50 mg/kg dozunda Quercetin 14 gün süresince, diğer yarısına ise (Grup 4B) 8. günden başlanarak 50 mg/kg dozunda 21 gün süresince i.p. olarak verildi. Sakrifikasyon işleminin ardından elde edilen akciğer dokuları ışık ve elektron mikroskobik, immünohistokimyasal ve moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak incelendi. Bulgular: Işık ve elektron mikroskobik incelemelerde hasar gruplarında interalveolar septumda yoğun şekilde kollajen birikerek alveolar yapının bozulduğu ve enflamatuvar hücre sayısında belirgin bir artış olduğu gözlenirken, Quercetin tedavisiyle fibrotik cevabın azaldığı ve alveolar yapıda iyileşme olduğu tespit edildi. İmmünohistokimyasal olarak α-SMA ekspresyonları hasar gruplarında yüksek seviyede iken tedavi gruplarında hasar gruplarına kıyasla daha düşük seviyede olduğu, E-Kaderin ekspresyonlarının ise hasar gruplarında azaldığı, tedavi gruplarında ise hasar gruplarına göre daha güçlü immünreaktivite gösterdiği görüldü. MiR-26b ve miR-27b ekspresyonlarının hasar gruplarında kontrol gruplarına göre düşük seviyede olduğu, tedavi gruplarında ise hasar gruplarından daha yüksek seviyede olduğu ve kontrol gruplarının seviyelerine yaklaştığı bulundu. Sonuç: Elde edilen bulgular değerlendirildiğinde, Bleomisin'le oluşturulan İdiyopatik Pulmoner Fibrozis modelinde Quercetin'in fibroziste azalan miR-26b ve miR-27b ekspresyon seviyelerini artırması ve gelişen histopatolojik değişiklikler üzerinde tedavi edici etkilerinin olması nedeniyle yeni bir tedavi ajanı olarak değerlendirilebileceği kanısına varıldı.
Yüksek glikozlu besiyeri ile deneysel diyabetik modelde hasara uğramış spermlere kök hücre ve niş ile desteklenmiş trombosit zengin plazma (PRP) ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) etkisi
Amaç: Bu çalışmada sağlıklı hayvanlardan alınan spermlerde kültür ortamında yüksek glikozlu besiyeri kullanılarak diyabetik hasar [DH] oluşturuldu. Spermlere mezenkimal kök hücre [MKH], 48 saatlik salgıladıkları faktörler olan koşullu besiyeri [KB] yani Niş ve Trombosit Zengin Plazma [PRP] ile desteklenmiş Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) uygulamaları yapılarak deneysel diyabetik modelde sperm hasarının azaltılması amaçlandı. Gereç ve Yöntem: 12 haftalık Wistar Albino cinsi 15 adet erkek sıçandan elde edilen spermler kültür ortamında 6 gözlü flasklara alınarak 15 farklı grup olacak şekilde belirlendi. Kontrol (KG), Sham (SG), DG, DG+ MKH, DG + KBY, DG+MKH+ KBY, DG+ PRP, DG+ SVF, DG+ MKH+PRP, DG+ MKH+ SVF, DG+ KBY+ PRP, DG+ KBY+ SVF, DG+MKH+ KBY+ PRP, DG+MKH + KBY+ SVF ve DG+ MKH+ KBY+ PRP+SVF olarak grupları ayrıldı. Üç saatlik uygulamada morfoloji, canlılık ve hareket değerlendirilmeleri yapılarak yaymaları hazırlanan örnekler oksidatif stres için e-NOS ve i-NOS ile apoptoz için TUNEL, CASPAZ 3, CASPAZ 8 ve CASPAZ 9 ile immünohistokimyasal olarak analiz edildi. Bulgular: DH besiyeri ortamının sperme verdiği hasarda oluşan morfolojik, canlılık ve hareket bozukluklarının artan eNOS ve iNOS ile artan apoptotik belirteçler ile ilişkili olduğu belirlendi. Uygulamaların istatistiksel olarak anlamlı bir biçimde sperm morfoloji, canlılık ve hareketini koruyarak oksidatif stres ve apoptozu azalttığı görüldü. Bireysel uygulamalarda olumlu etki varken MKH+KB+PRP+SVF kombinasyonunun anlamlı bir şekilde daha etkin olduğu saptandı. Sonuçlar: DH invitro modelin sperm hasarı yapması ve uygulamalar ile bu hasarın önlenebilmesi model olarak diğer tedavi olasılıkları için önemli olabileceğini gösterdi. MKH, PRP, KB ve SVF kombinasyonunun ilk defa kullanıldığı bu çalışma ile hücresel tedavi olarak hücre sayısının artırılması, büyüme faktörlerinin çoğaltılması ve sinyal mekanizmalarının güçlendirilmesi sonucunda oldukça yararlı olabileceği belirlendi. Toplumda yüksek prevalansta görülen ve giderek artan erkek infertilitesine yönelik hücresel tedavi gibi maliyetleri az ve etkinliği çok yeni rejeneratif yöntemin gelişmesine katkı sağlayacak sonuçlarımız çocuk sahibi olmak isteyen ailelere ümit olacaktır. Deney hayvanı ve insan çalışmaları ile bulguların doğrulanması ve mekanizmaların aydınlatılması klinikte kullanımlarını sağlayacaktır.
Pankreas duktal adenokarsinomunda (PDAC) yeni tümör baskılayıcı genlerin araştırılması
Amaç: Metilasyon reaksiyonları için ana metil donörünü sağlayan endositoz ve metiyonin yolağı, kanser patogenezinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu yolaklarda yer alan genler insanlarda sporadik mutasyonlara sahiptir ve in silico analizlere göre bu genlerin bazıları tümör baskılayıcı olarak rol oynayabilir. Bu çalışmanın temel amacı endositoz ve metiyonin döngüsünde rol alan Metiyonin Adenoziltransferaz 2A (Mat2a), Protein arjinine metiltransferaz 6 (Prmt6), Protein arjinin metiltransferaz 5 (Prmt5), Protein arjinin metiltransferaz 7 (Prmt7), SET ve MYND domeinini içeren protein 4 (Smyd4), DNA metiltransferaz 1 (Dnmt1) Ras ilişkili protein 11b (Rab11b), Ras ilişkili protein 4b (Rab4b), Selenoprotein I (SelenoI), Selenoprotein N (SelenoN) genlerinin hangilerinin, in vivo Kras kaynaklı PDAC gelişimi için tümör baskılayıcı gen olduğunu belirlemektir. Bunun yanında ikinci bir amaç ise, listelenen genlerden Smyd 4'ün PDAC gelişiminde tümör baskılayıcı olarak davrandığını in vitro ve in vivo olarak ortaya koymaktır. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda, bahsedilen yolaklarda yer alan 10 gen arasından tümör baskılayıcıları taramak için somatik CRISPR/Cas9 genom mühendisliği yönteminden yararlanıldı. Bulgular: Bu gen setlerinde tanımlanan tümör baskılayıcılardan biri, meme kanserinde lizin metiltransferaz Smyd4'tür. Çalışmamızda fare pankreas hücre hatlarında CRISPR/Cas9 aracılı Smyd4 delesyonu ortotopik fare modelinde hücre proliferasyonunu, yumuşak agarda koloni oluşumunu ve tümör oluşumunu arttırmıştır. Sonuçlar: Mekanizma olarak SMYD4 delesyonu, histon H3K9m2'nin spesifik bir aşağı yolak regülasyonuna yol açmıştır. Bu durum histon H3K9me3'ün SMYD4 demetilaz aktivitesi için spesifik bir substrat olduğunu düşündürdü. Ayrıca, in silico analizler ve hücre kültürü deneyleri ile Smyd4 delesyonu glikoz metabolizmasındaki değişikliklerle ilişkilendirildi. Sonuç olarak, lizin metiltransferaz Smyd4, PDAC için yeni bir tümör baskılayıcı olarak bu çalışmada tanımlanmıştır. Bunun yanında SMYD4'ün histon H3K9me3'ü spesifik olarak demetile ettiği ve glikoz metabolizmasını düzenlediği altta yatan bir mekanizma ortaya konulmuştur.
Missed abortus ve istemli evokuasyon olgularının endometriyumlarında proprotein konvertaz dağılımı
Missed abortus ve istemli gebelik evokuasyonu yapılan olguların desidua ve plasenta örneklerinde, birçok hücresel faaliyette rol oynayan TNF-? (Tümör Nekroz Faktörü-alfa), TGF-ß2 (Tümör Büyüme Faktörü-beta 2), IGF-I (İnsülin-benzeri Büyüme Faktörü-I), POMC (Pro-opiyomelanokortin), FOXO3A (Forkhead box O3A) ile proprotein konvertaz ailesi üyelerinden PC4 (Proprotein Konvertaz 4), PC6 (Proprotein Konvertaz 6), PC7 (Proprotein Konvertaz 7) ve FURİN moleküllerinin dağılımlarını immonohistokimyasal teknikle karşılaştırarak, missed abortus etiyolojisindeki etkileri araştırıldı. Çalışmaya Celal Bayar Üniversitesi Kadın Hastalıkları ve Doğum bölümüne başvuran, gebeliğin sonlandırılması kararı verilmiş missed abortus tanılı ve 10 hafta altı gebelik evokuasyonu istemi ile başvuran 10'ar hasta alındı. Her iki hasta grubundan endometriyal ve plasental doku örnekleri klasik doku takibi yöntemi ile bloklandı ve seri kesitleri alındı. Materyaller iki gruba ayrılarak incelendi. Seri kesitlerin birinci grubuna IHC uygulandı ve TNF-?, TGF-ß2, IGF-I, POMC, FOXO3A, PC4, PC6, PC7 ve FURİN primer antikorları ile immünohistokimyasal boyamalar uygulandı. Boyanan hücre sayısı H-Skor tekniği ile hesaplandı. Bu çalışmada, missed abortus olgularına ait desidua ve plasenta örneklerinde hücre proliferasyonu, invazyonu, migrasyonu, farklılaşması ve sağ kalımında rol oynayan TNF-?, TGF-ß, IGF-I, FOXO3A faktörlerinin artışı ve bu faktörlerin öncül formlarının posttranslasyonel modifikasyon yolu ile aktif formuna dönüşmesinde rol oynayan POMC, PC4, PC6 ve FURİN artışı ile paralellik göstermesi, bu faktörlerin fetal yaşam son bulduğu halde düşüğün gerçekleşmesini engellediğini düşündürdü.
Doksorubisin ile deneysel hepatotoksisite oluşturulmuş sıçanlarda Kurkumin'in koruyucu etkisinin ışık ve elektron mikroskobik düzeyde araştırılması
Amaç: Doksorubisinin neden olduğu karaciğer hasarında, Kurkuminin olası iyileştirici etkilerinin saptanması, kanser tedavisi sırasında kullanılan ilaca bağlı hepatotoksisitenin azaltılması ve kanser tedavisinin başarısına katkı sağlaması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Sunulan çalışmada 28 adet Wistar tipi albino sıçan 4 gruba ayrılarak deneysel model oluşturuldu. Grup 1: Kontrol grubu (n=7): 6 hafta boyunca her gün 1ml zeytinyağı gavaj yoluyla verildi. Grup 2: Kurkumin kontrol grubu (n=7): 6 hafta boyunca 1 ml zeytinyağında çözülen 200 mg/kg/gün dozunda Kurkumin gavaj yoluyla verildi. Grup 3: Doksorubisin grubu (n=7): 6 hafta boyunca haftada 2 kez 1mg/kg, toplamda 2mg/kg/hafta Doksorubisin ip olarak uygulandı. Grup 4: Doksorubisin+Kurkumin grubu (n= 7): Kurkumin 200 mg/kg/gün gavaj yoluyla verildikten 2 saat sonra, Doksorubisin 2 mg/kg /hafta ip olacak şekilde uygulandı. Altıncı haftanın sonunda anestezi altındaki sıçanlardan biyokimyasal analizler için intrakardiyak kan alınırken, ışık ve elektron mikroskopik inceleme için alınan karaciğer dokuları doku hazırlama tekniklerine uygun olarak hazırlandı. Bulgular: Doksorubisin uygulanan grupta belirgin kilo kaybı ile birlikte karaciğer enzimleri ALT ve AST düzeylerinde artış, SOD aktivitesinde düşüş, MDA aktivitesinde artış gözlenirken doksorubisin ile birlikte kurkumin uygulanan grupta ise tüm bu değerlerin kontrol gruplarındaki değerlere yakın olduğu görüldü. Ayrıca TNF-α ve Kaspaz-3 immünohistokimyasal ifadelerinin doksorubisin grubunda oldukça arttığı doksorubisin+kurkumin uygulanan grupta ise bu ifadelerin anlamlı bir şekilde azaldığı görüldü. Histokimyasal boyamada Doksorubisin uygulanan grupta karaciğerde kollajen liflerin arttığı gözlenirken, ışık ve elektron mikroskobik değerlendirmelerde ise hepatositlerde piknotik çekirdekler, mitokondriyonlarda dejenerasyon ve kümeleşme, GER sisternalarında kümeleşme ile karakterize dejeneratif değişiklikler ile birlikte enflamatuvar hücre infiltrasyonu, konjesyon, ito hücreleri ve eozinofillerde artış olduğu saptandı. Doksorubisin+Kurkumin uygulanan grupta ise biyokimyasal, immünhistokimyasal, histokimyasal, ışık ve ultrastrüktürel değerlendirmeler kontrol grubundakiler ile benzerlik göstermekteydi. Sonuçlar: Doksorubisin kullanımı sonucunda sıçanlarda görülen kilo kaybı ve karaciğer enzimlerinin seviyelerindeki değişiklikler ile birlikte hepatositlerde nekroptozis ve apoptozis adı verilen programlı hücre ölüm şekillerinin olduğu ve fibrozisin geliştiği saptanırken doksorubisin ile birlikte kurkumin uygulanan grupta apoptozis ve nekroptozisin azaldığı, fibrozis izlenmediği görüldü. Bu nedenle Kurkumin kullanımının, Doksorubisin ile oluşturulan hepatotoksisitede hepatositler üzerinde koruyucu ve tedavi edici etkilerinin olduğu kanaatine varıldı.
Oosit maturasyonu ve arrestinde tubal sıvı kültür ortamının yeri
Oosit matürasyonu embriyonik dönemde başlayıp, mayoz I'in profaz safhasında duraksar ve puberte ile birlikte gelişmeye başlayan foliküllerden fertilizasyon için uygun oositin atılımı gerçekleşir. Oosit gelişimi sırasında mayoz I ve Mayoz II evrelerini kontrol eden birçok moleküler mekanizma bulunmaktadır. Bu mekanizmalar sayesinde oositin bir fazdan diğer faza geçişi sağlanmakta ve fertilizasyon için olgun oosit gelişimi tamamlanmaktadır. Kadın infertilite sebeplerinden oosit matürasyonundaki aksaklıklar ve/veya oositin mayozun herhangi bir aşamasında duraksaması (arrestte kalması) sonucu fertilizasyonun gelişememesi görülebilmektedir. Bu nedenle in vitro şartlarda oosit kültür ortamlarının geliştirilmesi gereklidir. Uygun kültür ortamlarının sağlayabilmesi ve kültür ortamındaki embriyo canlılığının korunabilmesi için, in vivo şartları mümkün olduğunca taklit edebilen kültür sistemlerine ihtiyaç vardır. Bu amaçlara yönelik IVF kültür vasatlarına ek olarak ko-kültür sistemleri de tercih edilebilmektedir. Bu veriler doğrultusunda çalışmamızda oosit kültür ortamında matürasyonu ve arresti üzerine tubal sıvı kültür ortamının etkisi ve bu ortamda kültüre edilmiş oositlerin embriyo geliştirebilme potansiyelleri de öngörülmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda superovulasyon işleminden sonra elde edilen mayoz 1 ve mayoz II evresindeki oositler, oosit kültür vasatı içerisinde kültüre edildi. İlk grupta mayoz 1 aşamasında Metafaz I oosit kültürü ve Metafaz I oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli olan oositler, 2. gruptaki oositler ise mayoz 2 aşamasında olup Metafaz II oosit kültürü ve Metafaz II oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli olan oositler kültüre edildi. Böylelikle toplam 4 grup incelendi. Gruplar: Grup 1: Metafaz I Oosit kültürü Grup 2: Metafaz I Oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli Grup 1: Metafaz II Oosit kültürü Grup 2: Metafaz II Oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli Kültürün 48. saatinde oositler whole mount immunohistokimyasal analiz yöntemi ile anti-siklin B, anti-MPF, ve anti-MOS dağılımları immunofleurosans boyama tekniği ile incelendi. Eş zamanlı olarak apoptotik hücrelerde TUNEL yöntemi ile incelendi. Bununla beraber ovariyan döngü sırasında salgılanan anti-siklin B, anti-MOS ve anti-MPF birincil antikorlarının dağılımları için yukarıda tarif edilen oosit eldesi ile eş zamanlı olarak ovaryum örnekleri alındı (5 adet fareden) ve rutin parafin takibi sonrasında elde edilen kesitlerde anti-siklin B, anti-MOS ve anti-MPF dağılımları indirekt immunoperoksidaz yöntemi ile incelendi. Ovarian doku kesit örneklerinde TUNEL yöntemi uygulanarak apoptotik hücre tanımı yapıldı. Mayoz I döneminde alınan oositlerin tubal sıvı ile kültür sonrasında Mayoz II aşamasına geçtikleri gözlenirken, Mayoz II dönemindeki oositlerin tubal sıvı kültürü içinde canlılıklarını korudukları ve özellikle Emi salınımı ile her iki dönemdeki oositlerin canlılıklarının korundukları saptandı. Ovaryum dokusunda da Emi salgısı erken dönemde pozitif iken, MOS and Siklin-B salgılarının follikül gelişimi ile birlikte arttıkları saptandı. Sonuç olarak oosit matürasyonunda Emi salgısı önemli iken, gelişen folliküllerde MOS ve Siklin-B salgılarının önemli olduğu ve oosit canlılığı ile ilişkili oldukları sonucuna varıldı.
Menopozal insan over yüzey epitelindeki embriyonik kök hücrelerin oosit benzeri ve blastosist benzeri hücrelere farklılaşmasında PTEN-PI3K-AKT-FOXO3 sinyal yolağının rolü
Amaç: Bu çalışmada Postmenopozal kadınlarından alınan overlerin over yüzey epitelinden embriyonik benzeri kök hücrelerin elde edilmesi ve oosit benzeri hücrelere farklılaştırılması planlandı ve üç haftada farklılaşması beklenen hücrelerin birinci hafta, ikinci hafta ve üçüncü hafta sonlarında alınan örneklerden kök hücre belirteçleri ve bu dönemde PTEN-PI3K-AKT-FOXO3A sinyal yolağında oluşan değişikliklerin incelenmesi amaçlandı. Materyal ve Metod: Çalışmaya Celal Bayar Üniversitesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ile Merkez Efendi Devlet Hastanesi Doğumevi Kliniğine çeşitli jinekolojik hastalıklar nedeni başvuran ve ile opere olan, etik onam formunu imzalayan, postmenopozal kadın hastalardan toplanan over doku örnekleri ve over doku örneklerinden elde edilen OYE hücre kültürleri birinci hafta, ikinci hafta ve üçüncü hafta örnekler alınarak rutin histokimyasal ve anti- OCT-4, anti-SSEA-4, anti-C-KİT, anti-VASA, anti- anti-ZP-4, anti-CK-18, anti-PTEN, anti-PI3K, anti-pAKT1/2/3, anti-FOXO3 primer antikorları kullanılarak avidin-biyotin-peroksidaz yöntemi ile indirekt immünohistokimyasal boyamalar uygulandı. Bulgular: Over doku örneklerinin, Hematoksilen- Eozin ile boyanmış preparatlarında, postmenapozal kadınlardan alınmış olması nedeni ile primordial veya gelişmekte olan folliküller yapılar gözlenmedi . Tek katlı kübik epitel olarak over yüzey epiteli gözlendi. İmmunohistokimyasal incelemelerde Doku örneklerindeki OYE hücreleri arasında bulunan OCT-4, SSEA-4, C-KİT, eksprese eden kök hücrelerin olduğu gözlendi ve kortikal bölgede OCT-4 ve SSEA-4'te boyanma gözlenmezken, C-KİT, PTEN, PI3K, AKT, FOXO3A'da gözlendi. CK-18'de epitelde boyanma gözlendi. ZP-4, kök hücrelerin ve epitel hücrelerinin eksprese ettiği gözlendi. VASA'da tüm dokularda yaygın olarak eksprese edildiği gözlendi ve bu artefakt olarak değerlendirildi. Hücre kültürü örneklerinde OCT-4, SSEA-4 ikinci gün ve birinci hafta örneklerinde boyanırken, VASA ve C-KİT ikinci haftada, ZP-4 üçüncü haftada ve CK-18'in tüm haftalarda boyandığı gözlendi. Sonuç: Alınan yüzey epitel hücreleri üçüncü haftada "oosit benzeri" ve "blastosist benzeri" hücrelere dönüştükleri tespit edildi. Postmenopozlu kadınların overlerinde folliküller yapılar bulunmamasına rağmen yüzey epitel hücreleri arasında kök hücrelerin varlığı ilginç bulundu. Bu hücrelerden oosit benzeri hücrelerin gelişebileceği gösterildi. OYE hücreleri arasında bulunan kök hücrelerin, oosit ve/veya blastosist benzeri hücreye dönüşmesindeki sırasında PTEN-PI3K-AKT-FOXO3A yolağının aktif fonksiyon gösterdiği tespit edildi. OYE içerisinde bulunan kök hücrelerin varlığı ve oositlere dönüşebilme yeteneği, bu hücrelerin over yetmezliği vakalarında kullanılmasına olanak sağlayabileceği ve ayrıca OYE'den elde edilen kök hücrelerin veya embriyoların değişiklik dokulara farklılaştırılmasının, rejeneratif tıpta da yeni ufuklar açabileceği düşünüldü
Farklılaştırılmış kök hücre uygulamarının over hasarındaki yeri
Modernleşen dünyada çevresel faktörler üreme hücreleri üzerine gittikçe artan bir şekilde olumsuz etki göstermektedir. Özellikle Avrupanın Kuzey bölgesinde ciddi bir sorun haline gelen bu problem ülkemizde de artmaktadır. Birçok farklı hücrenin etkileşmesi sonrasında gerçekleşen fertilizasyon bu hücrelerden aldığı sinyaller sonrasında embriyonun gelişmesini sağlayan birçok farklı mekanizmayı gerçekleştirmektedir. İnfertilizasyon dediğimiz durum bu hücrelerin etkileşmesindeki eksikliklere bağlı olarak oluşmaktadır. Kök hücre uygulaması ile amaçlanan kök hücrenin kendi oluşturduğu sinyaller ve çevreye gönderdiği uyarılar sonucu bu eksik olan etkileşmelerin yeniden sağlanmasıdır. Bu çalışmada over dokusunda oluşan yara sonrasında iyileşme periyodu ve bu sırada gerçekleşen oogenezin etkileşmesi ve kök hücrenin hem kendi farklılaşması hem de oluşturacağı niş denilen mikroçevre sayseinde katkıları incelencektir. Metod: Hücre kültüründe in vitro olarak kültüre ettiğimiz kemik iliği stromal kök hücrelerini fare overlerine genel anestezi altında ppd enjektörü yardımıyla enjekte ederek yara modeli oluşturduk. Kurgulanan gün aralıklarını takip ederek hayvanları servikal dislokasyon yöntemi ile öldürerek overlerini çıkardık. %10'luk formalinfiksasyonunu sağladık ve parafin bloklama yöntemi ile blokladık. 5 micron inceliğinde rodajlı ve polilizin kaplı lamlara alıdığımız doku kesitlerini bir gece 37 ºC' de etüvde beklettikten sonra ertesi gün hematoksilen boyaması ve indirekt immünohistokimyasal boyama protokolünü takip ederek e-NOS, i-NOS ve STRO 1A antikorları ile boyadık ve TUNEL boyaması yaptık. Sonuç: Bu çalışmada biyopsi modellemesi ile over dokusunda hasar oluşturulup oluşan hasara KİSKH uygulaması yapılıp tedavi sürecine katkısı 3. Günde en aktif yara oluşumu gözlenirken 14. Günde iyileşmenin gerçekleştiği saptandı ve kök hücrenin yedinci gün gruplarında anlamlı bir şekilde iyileşmeyi hızlandırdığı ve olumlu katkılar sağladığı saptandı. Kök hücre varlığı STRO-1 boyaması ile ortaya konulup kemik iliği stromasından alınan mezenkimal kök hücrelerin 4. Pasaja geldiğinde hoöojen bir yapıya kavuştuğu ve klasik kök hücre gibi davrandığı bulundu. Kök hücrenin over dokusundaki hasara katkısı hem parankimin tamiri hemde oogenez sürecinde folikül oluşumuna katılan hücrelere verdiği destek saptandı. primer oositten graaf folikülüne ve teka ile granüloza hücrelerine olumlu katkılar sağladığı izlendi. NOS boyamaları ile sürecin oksidatif hasar ile gerçekleştiği e-NOS daha belirgin olmak kaydı ile i-NOS immun boyamalarının bazale göre çok fazla arttığı saptandı. Oksidatif stresin hücre ölümü üzerine ilişkilsi ve etkili olduğuda TUNEL boyamalarındaki artışla belirlendi. Kök hücrenin serbest radikal oluşumunu azaltıp hasarı engellediği ve buna bağlı olarak apoptozun gerilediği düşünüldü. Kök hücrenin bu olumlu etkilerinin günümüz kadınının beslenme, teknoloji ve ilgil faktörler nedeniyle bozulan over sağlığının ve buna bağlı azalan üreme yeteneğinin yeniden kazandırılmasında önemli olabileceğini düşündürdü. Kök hücrenin overdeki olumlu etkilerine niş faktörünün eklenmesi, folikül yapımına ve atılmasına katkısının belirlenmesi, graaf folikülünün oluşume ve atılmasını sağlayan tüm destek hücrelerle bu hücrelere katkı sağlayan bağ dokusu hücrelerinin kök hücreler ile tekileşimlerinin ortaya konması ve burada kullanılan mekanizmaların ortaya konması çalışmadan çıkarılan sonuçların getirdiği önerilerdir. Kök hücrenin kullandığı mekanizmalar olan oksidatif stres ve proglanmış hücre ölümü akıllıca kullanıldığı taktirde önleyici ve tedavi edici olarak klinik tıpta yerini alacak önemli bir silah olarak gözükmektedir. Bu ifadenin her geçen gün azalan üreme yeteneğine katkısı gelecekteki fonksiyonu açısından en önemli yorumdur (Stimpfell M. ve ark. 2013).
Sıçan testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon hasarında, pı3k-akt-mtor yolakları üzerinden cape ve EGCG'nin koruyucu etkilerinin değerlendirilmesi
Testis torsiyonu veya spermatik kordun torsiyonu özellikle çocuklarda ve genç erkeklerde görülen, çoğunlukla cerrahi işlem gerektiren ürolojik vakalar arasında yer almaktadır. Erken tanı konulup testisin korunduğu vakalar dahil olmak üzere, erkek infertilitesinde gözlenen en önemli nedenlerden biridir. Testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon hasarı üzerine yapılan çalışmalarda, koruyucu olarak birçok antioksidan çeşitli vitamin ve ilaç kullanılmıştır. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) yeşil çayın % 80'ini oluşturan flavonoidler arasında yer almaktadır. Yeşil çayda yer alan EGCG ile, testiküler androjen üretimindeki sinyalizasyon yolakları olan protein kinaz A (PKA) ve protein kinaz C'nin (PKC) ilişkili olduğu, ancak hangi yolağı takiben testesteron üretimi yaptığı yada testis üzerindeki koruyucu işlevi olduğu bilinmemektedir. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE-Propolis) ise flavonoidlere benzeyen bal arısı propolisinin aktif bir bileşenidir. CAPE'nin antioksidan, antienflamatuvar, antiviral ve immünomodülatör olduğu gösterilmiştir. mTOR (mammalian target of rapamycin), birçok kritik hücre içi olayları düzenleyen temel kinaz enzimlerinden biridir . mTOR, serin-threonin kinaz ailesinden PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağına dahildir. mTOR hücre büyümesi, hücre çoğalması, protein sentezi ve transkripsiyonu, anjiyogenez, apoptoz ve otofajiyi etkilemektedir Bu çalışmada, genç erişkin Wistar Albino sıçanlarda testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon sonrası oluşan doku hasarında, P13K-Akt-mTOR sinyal ileti yolaklarının öneminin ve antioksidan ajanlar arasında yer alan Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) ve Caffeic acid phenethyl ester (CAPE)'in testis hasarı üzerindeki koruyucu etkilerinin biyokimyasal, histopatolojik ve immunohistokimyasal olarak değerlendirilmesi planlanmıştır. Biyokimyasal kan analizlerinde MDA, Katalaz ve 8-OHG düzeyleri ölçülerek değerlendirilecektir. Histopatolojik olarak testiste seminifer tübülüsü oluşturan spermatogenez sürecindeki tüm hücrelerin ve Sertoli hücreleri ile interstisyel Leydig hücrelerinin morfolojik olarak Johnson's skorlaması ile değerlendirilmesi yapılacaktır. Histopatolojik inceleme ile, iskemi/reperfüzyon hasarında EGCG ve CAPE uygulamalarının koruyucu etkileri olup olmadığı ışık mikroskop altında değerlendirilmiş olacaktır. DNA hasarı TUNEL yöntemi kullanılarak değerlendirilecektir. TUNEL pozitif boyanan hücreler % olarak belirlenerek, sonuçlar gruplar arasında karşılaştırmalı olarak ANOVA istatistik testi ile değerlendirilecekltir. İmmünohistokimyasal olarak PI3K-Akt-MTOR yolağında yer alan primer antikorları ile, apoptotik süreçte ekstrensek ve intrensek yolakların etkilenmelerini göstermek amacı ile Caspas 8 ve Caspas 9 primer antkorları ile indirek immunohistokimyasal yöntemle değerlendirme yapılacaktır. İmmunohistokimya boyanma skorları, yarı-kantitatif yöntemle hafif (1), orta (2), şiddetli (3) ve çok şiddetli (4) olarak belirlenerek h-Skor hesaplanacaktır. Toplam boyanan hücre sayıları belirlenerek (boyanma yoğunluğu +1) ile çarpılarak belirlenen h-skor'lar gruplar arasında ANOVA istatistik testi ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilecektir. Bu çalışma sonunda, EGCG ve CAPE'in infertilite nedenlerinden biri olan testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon hasarı üzerine etkileri moleküler düzeyde değerlendirilmiş olacaktır. Tedavinin koruyucu etkileri izlenerek, antioksidanların tek tek ya da birlikte kullanıldıklarında sinerjik etkilerinin önemi ortaya konulacaktır
Kök hücre uygulamasının kök hücre uygulamasının sıçan modelinde in vitro fertilizasyon üzerine etkileri
Günümüzde artan bir şekilde sorun haline gelen çocuk sahibi olamama durumu, geliştirilen yeni tekniklerle aşılmaya çalışılmaktadır. Bu tekniklerin önemli bir tanesi ise fertilizasyonun laboratuar koşullarında sağlandığı in vitro fertilizasyon (İVF) olup başarı oranı maalesef hala yeterli değildir. Bu başarının artırılması için değişik besiyeri, büyüme faktörleri ve hormonlar gibi etkenler ile daha iyi sonuç elde edilmeye çalışılmaktadır. Kök hücreler organizmanın kendi bünyesinde bulundurduğu kolayca elde edilen ve faktörler aracılığı ile yönlendirilen öncül hücrelerdir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda bu kök hücrelerin bizatihi kendilerinin dışında salgıladığı faktörler ile niş denilen bir mikroçevre oluşturarak özellikle kanser hücrelerinde olmak üzere diğer hücreleri olumlu yönde etkiledikleri bilinmektedir. Bu çalışmada sıçanlardan toplanan oositler, kök hücre ortamında ve kök hücrenin beklediği besiyeri ile muamele edilerek fertilizasyona etkisi ve embriyo gelişimine etkisi saptandı. Kök hücre mikroçevresinin fertilizasyon üzerine etkileri ilgili parametrelerle ortaya konup daha kaliteli bir embriyo ve daha başarılı bir gelişim saptanmaya çalışıldı. Bu çalışmada, erişkin ve ortalama ağırlıkları 250 ± 50 gr wistar sıçanlar kullanıldı. Erkek ve dişi sıçanlardan alınan sperm ve oositler kök hücre niş etkisine maruz bırakılarak oluşan değişiklikler olgunlaşma açısından incelendi. Dişi sıçanlar süperovulasyon yapılan ile yapılmayan olarak iki gruba ayrıldı. Bu iki gruptaki sıçanlardan toplanan oositler İTSBY (İnsan Tubal Sıvı Besiyeri), SSBY (Single Step Besiyeri), AMBY (Alfa-MEM Besiyeri) ve KİMKHBY (Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücre Besiyeri) içerisine eşit miktarlarda olacak şekilde oositler paylaştırıldı. Erkek sıçanlarda epididimisten spermler toplanarak kriterler açısından değerlendirildi. Bu spermler oositlerin bulundukları besiyerleri içerisine ortalama bin sperm olacak şekilde sperm solüsyonu eklendi. İVF yapılan örneklerde oluşan embriyolar on birinci güne kadar izlendi. Fertilizasyon ve embriyo gelişimine etkileri ile arrest, dejenerasyon oranları ve canlılığı süren embriyoların durumları ortaya kondu. Çalışmamızda İTSBY, SSBY, AMBY ve KİMKHBY'ne maruz bırakılan oositlerde sıfır ile dokuzuncu günler arasındaki süreçte oosit olgunlaşması, iki ile on altı hücreli ve morula safhasında embriyoların oluştuğu gözlendi. Aynı şekilde spermlerin hareket, sperm kalitesi ve canlılığı yönünden etkileri ortaya kondu. Olgunlaştırılan germ hücrelerinin fertilizasyon ve embriyo gelişimine etkisi AMBY besiyerinde çok az iken, İTSBY ve SSBY besiyerlerinde daha iyi olduğu ancak en iyi etkinin KİMKHBY ile oluştuğu gözlemlendi. Kök hücre nişinin, oosit ve spermin olgunlaşmasına, kalitesine ve canlılık süresini uzatmasına önemli etkisinin olduğunu gözlemledik. İVF açısından da KİMKHBY embriyo kalitesine ve canlılığına önemli ölçüde katkı sağladığını gösterdik. Sonuç olarak kök hücre uygulamalarının infertiliteye yönelik tedavi için bir umut olmakla kalmayıp koruyucu bir yaklaşım olarak kullanılabileceği görüldü. Ayrıca mezenkimal kök hücre tedavisinin zarar vermeme anlamında etkinliği ve güvenilirliği çalışmamızın sonuçlarını daha da önemli hale getirmektedir. Kök hücre uygulamalarının germ hücresine yaptığı etkilerin mekanizmalarının anlaşılması IVF için hala yeterli olmayan başarının artmasını sağlamada büyük önem taşıyacaktır.
Yüksek fruktozlu mısır şurubu ile beslenmenin sıçan overlerinde oluşturduğu hasarda yağ dokusu kaynaklı kök hücrenin etkisi
Amaç: Son zamanlarda şekerli beslenme toplum sağlığı açısından önemli bir problem oluşturmakta özellikle mısır şurubu gibi ucuz şekerlerden yapılan tatlılardan şişmanlık ve şeker hastalığını da içeren üreme sağlığını etkileyen hastalıklara neden olmaktadır. Kök hücrenin rejeneratif tıp alanında kullanımı tedavi biçimini almış ve birçok farklı hastalıklar için de deneysel olarak incelenmeye başlanmıştır. Bu çalışmada Yağ Doku Kaynaklı Kök Hücre (YDKH) uygulamasının Yüksek Fruktozlu Mısır Şurubu (YFMŞ) ile sıçan over dokusunda oluşan hasar sonrası iyileşme sürecine olan etkisini belirlemek amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Çalışmada Wistar dişi sıçanlar kullanıldı. Her grupta 4 hayvan olacak şekilde sıçanlar 6 gruba ayrıldı. 1.Grup: Kontrol grubu; 2.Grup: YFMŞ grubu; 3.Grup: STZ grubu; 4.Grup: Sham grubu; 5.Grup: YFMŞ + YDKH grubu; 6.Grup: STZ + YDKH grubu. Kontrol ve STZ uygulanan gruplar dışında diğer gruplar YFMŞ içeren içme suyu ile beslendi. YDKH uygulanan gruplara haftada bir kez 1x106/ml YDKH intraperitoneal olarak enjekte edildi. Sham grubuna eşit miktarda hücre kültür besiyeri enjekte edildi. Deney öncesi ve sonrası hayvanların ağırlıkları ölçüldü. Açlık kan şekerleri (AKŞ) deney öncesi ve 4 haftada bir kez ölçüldü. Deney sonrası hayvanların over dokuları toplandı. Histolojik değerlendirmeler ve oksidatif stres açısından eNOS, iNOS antikorları ile, damarlanma durumunun belirlenmesi için VEGF antikoru ile apoptoz açısından TUNEL boyamalarında immünohistokimya değerlendirmeleri yapıldı. İstatistiksel analizler için ANOVA testi yapıldı. Bulgular: Çalışmamızda YFMŞ ve STZ uygulanan sıçanların vücut ağırlıklarının istatistiksel olarak anlamlı (p<0.001) azalış gösterdiği bulundu. YFMŞ uygulama sonrası sıçanların kan şekeri ortalama yüksek olup kontrol gruptaki ortalama düzeyden anlamlı (p<0.001) olarak arttığı gözlemlendi. YDKH uygulama sonrası YFMŞ ile beslenen sıçanların ağırlıkları YDKH uygulanmayan grup ile karşılaştırıldığında belirgin (p>0.05) bir fark göstermez iken AKŞ düzeylerinde anlamlı (p<0.001) bir düşüş saptandı. STZ uygulanan gruplarda da YDKH uygulama sonrası AKŞ düzeyi belirgin (p<0.001) bir düşüş gösterdi. Histolojik incelemede YFMŞ ve STZ uygulanan gruplarda folikül sayısında azalma, konjesyon gösteren stroma gibi patolojik sonuçlar bulundu. İmmünohistokimyasal incelemeler sonucu YFMŞ ve STZ uygulanan gruplarda oksdatif stres açısından eNOS ve iNOS ekspresyonların arttığı, VEGF ekspresyonun arttığı bunun ile beraber özellik ile YFMŞ uygulanan gruplarda bu artışların daha belirgin (p<0.001) olduğu saptandı. Apoptozun belirlendiği TUNEL boyamalarında STZ uygulanan gruplarda daha belirgin (p<0.001) bir hücre ölümünün ortaya çıktığı anlaşıldı. YDKH uygulama sonrası patolojik değişikliklerin azaldığı bulundu. Sonuç: YFMŞ tüketilmesinin deneysel sıçan modelinde hiperglisemiye yol açtığı aynı zamanda over dokusunda patolojik bozukluklara neden olduğu gösterildi. Bu patolojik bozuklukların serbest radikallerin ve ona parelel hücre ölümünün artması ile ortaya çıktığı gösterildi. YDKH'nin YFMŞ ve STZ uygulama sonrası oluşan metabolik ve patolojik bozukluklara iyileştirme etkisinin olduğu bunu oksidatif stres ve beraberinde gelişen apoptozu azaltıp damarlanmanın azalması ile gerçekleştirdiği saptandı.
Deneysel alzheimer hastalığında TGF-β1'in prefrontal korteks ve hipokampuste aβ-40 ve α- β- γ sekretaz ekspresyonu üzerine etkileri
Alzheimer hastalığı, (AH) öğrenme ve hafıza fonksiyonlarında bozulma, günlük yaşam aktivitelerinde gerileme ile karakterize kronik, kompleks nörodejeneratif bir hastalıktır. Amiloid plaklar, nörofibriler yumak oluşumu, nöron ve sinaps kaybı ile beyinde belirgin atrofi, hastalığın en önemli histopatolojik bulgularıdır. Günümüze kadar hastalığın etiyolojisi, patogenezi ve histopatolojisi ile ilgili çok sayıda faktörün varlığı öne sürülmüş olmakla birlikte, mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmış değildir. Amiloid beta (Aβ) birikimi, hastalığın patogenezinden sorumlu en temel değişikliktir. Aβ-40 ve Aβ-42 patogenezde yer alan önemli amiloid beta türleridir. β-sekretaz ve γ-sekretaz enzimlerinin hiperaktivasyonu sonucu amiloid prekürsör proteinin (APP) anormal kesimi ile amiloid plak oluşumu meydana gelmektedir. Dönüştürücü büyüme faktörü β1 (TGF-β1), hücre metabolizması, doku homeostazı, nöronal gelişim ve sinaptik plastisitede kritik rollere sahip önemli bir büyüme faktörüdür. TGF-β1'in, nörodejeneratif hastalıkların oluşumu ve ilerlemesinin önlenmesinde antienflamatuvar etkisi ile yararlı olabileceği ileri sürülmüştür. TGF-β1'in eksitotoksisite, iskemi ve hipoksi koşullarında nöron koruyucu etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Yaşlanma ve kronik enflamasyonlarda, TGF-β1/Smad sinyalinin inaktivasyonu, mikrogliya aracılı nörodejenerasyonu uyarmaktadır. Dolayısıyla TGF-β1 sinyalizasyonunun düzenlenmesi, AH tedavisinde yeni bir farmakolojik strateji olabilir. Literatürde TGF-β1'in nöroprotektif etkisini gösteren çalışmalar yer alsa da Alzheimer hastalığında TGF-β1'in Aβ birikiminde etkin rol olan sekretaz enzimleri üzerine etkisi ile ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada deneysel AH benzeri hastalık modelinde TGF-β1'in α, β ve γ-sekretaz enzimlerinin regülasyonu, Aβ-40 birikimi, apopitoz ve nöronal hasar üzerine etkisinin incelenmesi amaçlandı. Seksen sekiz adet erkek Swiss-Albino cinsi fare rastgele ayrılarak, herhangi bir uygulamanın yapılmadığı kontrol grubu, yalnızca SF uygulamasının yapıldığı sham grubu, TGF-β1 uygulanan grup, 28 gün boyunca Skopolamin uygulanan deney grubu ve Skopolamin+TGF-β1 uygulanan tedavi grubu olmak üzere 5 gruba bölündü. Tedavi grubunda yer alan fareler kendi içinde 2 alt gruba ayrıldı. Sham, TGF-β1 kontrol, deney, tedavi-1 ve tedavi-2 grupları 56. güne kadar bekletilerek uygulanan yöntemlerin uzun süreli etkileri de incelendi. 28. ve 56. Günlerde Moris su havuzu testi uygulanarak hafıza ve bellek fonksiyonları incelendi. Tüm gruplardan 28. ve 56. günlerde alınan hipokampus ve prefrontal korteks dokuları ışık ve elektron mikroskobik, immunohistokimyasal ve biyokimyasal yöntemlerle incelendi. Moris su havuzu testinde deney gruplarında, hafıza ve bellek performansının azaldığı görülürken, tedavi gruplarında hafıza ve bellek performansının tekrar yükseldiği gözlendi. Aβ-40 ve kaspaz-3 immunreaktivitesinin hipokampus ve prefrontal kortekste deney grubunda 28. ve 56. günlerde arttığı, TGF-β1 tedavisi sonucu immunreaktivitenin azaldığı gözlendi. Işık ve elektron mikroskobik incelemelerde deney gruplarında nöronlarda ve gliya hücrelerinde yapısal değişikliklerin varlığı tespit edildi. TGF-β1 tedavi gruplarında hücresel değişikliklerin nispeten azaldığı gözlendi. α-sekretaz ekspresyonunun deney gruplarında azaldığı görülürken, tedavi gruplarında arttığı tespit edildi. β ve γ- sekretaz enzim seviyelerinin deney gruplarında arttığı, tedavi gruplarında ise azaldığı belirlendi. Skopolaminle oluşturulan Alzheimer benzeri hastalık modelinde TGF-β1'in hafıza ve bellek performansını arttırarak, Aβ-40 birikimini engellemesiyle Alzheimer hastalığı üzerine tedavi edici etkisinin olabileceği düşünüldü. Ayrıca kaspaz-3 ekspresyonunu down-regule ederek nöronal hasarın önlenmesinde etkili olabileceği belirlendi. Aynı zamanda α, β ve γ-sekretaz enzimleri üzerinde düzenleyici rolü ile hastalığın önlenmesinde etkili olabileceği gösterildi. Bütün bulgular birlikte değerlendirildiğinde, TGF-β1'in Alzheimer hastalığında tedavi edici bir ajan olarak değerlendirilebileceği kanaatine varıldı.
İmplantasyon sürecinde eksprese olan mirna'lar ve önemi
Kadın üreme sistemi ovaryum, fallop tüpü, serviks ve uterusdan oluşur. Başarılı bir implantasyon süreci için oosit ve sperm morfolojisi önemli olmakla beraber, fertilizasyonun sorunsuz gerçekleşmesi ve gelişen embriyonun tuba uterina içinde morula aşamasına kadar geldikten sonra implantasyon bölgesine ulaşması gerekmektedir. Tüm bu aşamalar gerçekleştikten sonra implantasyon için ise endometriyumun kabul edilebilirliği, embriyonun da tutunması ön plana çıkar. Sebebi açıklanamayan infertil olgularda özellikle endometriyal problemlerin daha fazla olduğu görülmektedir. İmplantasyon süreci hem endometriyum hemde embriyodan salgılanan faktörler ve bu faktörlere uygun olarak embriyo ve/veya endometriyum üzerindeki reseptörler aracılığı ile kontrol edilir. Fertilizasyon ve erken embriyonik gelişim normal olarak gelişmesine rağmen endometriyal kabul edilebilirliğinin olmadığı durumlarda implantasyon gerçekleşmediğinden embriyonal ileri gelişim gerçekleşememektedir. MikroRNA (miRNA'lar) transkripsiyon sonrası gen ekspresyonunu kontrol eden küçük kodlanmayan RNA'lardır. 700'den fazla insan miRNA'sı tespit edilmiş olup hem normal hem de patolojik durumlarda hücre içi döngünün düzenlenmesinde önemli rol oynadıkları gösterilmiştir. Son yıllardaki çalışmalar ile kadın üreme sistemi organlarında farklı dönemlerde farklı miRNA'ların farklı ekspresyonları olduğu gösterilmiş ve normal olarak düzenlenmesi ve anormal olgulardaki dağılımları ve rolleri araştırılmaya başlanmıştır. Çalışmada fertil ve infertil olgularda endometriyal siklusun proliferasyon ve erken sekresyon dönemlerinde alınan endometriyal biyopsi örneklerinde eksprese edilen mikro RNA'ların belirlenmesi ve implantasyon süreci ile birlikte infertilite olgularındaki dağılımlarının incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç için 25-38 yaşları arasında Celal Bayar Üniversitesi Tüp Bebek Merkezi ile Hafsa Sultan Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum kliniğine başvuran fertil ve infertil olgulardan proliferasyon ve erken sekresyon dönemlerinde örnekler alınacaktır. Alınan örneklerin bir kısmı histolojik analiz için %10 formalin solüsyonuna, kalan örnekler ise miRNA analizi için direkt olarak sıvı azot içine alınarak saklanacaktır. Histolojik analizler için örnekler rutin parafin takip işleminden sonra morfolojik analizi için hematoksilen-eozin (H-E) ile boyanacak, immunohistokimyasal analizi için anti-ago1, anti-dicer, anti-drosha, anti-eIF2 dağılımlarına bakılacaktır. miRNA analizleri için örneklerde RNA ekstraksiyonu yapıldıktan sonra RNA izolasyonu ve kalitesinin ölçülmesi kantitatif real time polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemi ile, belirlenen miR-17-5p, miR-23a, miR-23b, miR-542-3p, miR-21, miR-199a*, miR-705, miR-20a, miR-26a, miR-125b, miR-200a/b/c analiz edilecektir.
Düşük (67nr) ve yüksek (4t1) metastatik potansiyeli olan meme kanser hücre hatlarında tedavinin toll–like reseptörler üzerine etkisinin immunohistokimyasal ve western blotting yöntemleri ile değerlendirilmesi
Amaç: Bu çalışmada, in vitro olarak düşük (67NR) ve yüksek (4T1) metastatik potansiyeli olan meme kanser hücre hatlarında Wortmannin ve Talidomid uygulamalarının Toll-Like Reseptörleri (TLR) üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Meme kanser hücre hatlarının ikilenme zamanları hesaplandı ve MTT testi ile ilaçların IC50 değerleri Wortmannin için 2,5 μM ve Talidomid için 50 μM olarak belirlendi. 24 ve 48 saat ilaç uygulamaları sonrasında hücreler TUNEL, anti-TLR2, anti-TLR4, anti-MyD88, anti-NFκB ve anti-PI3K primer antikorları ile indirekt immünohistokimya ve Western Blotting yöntemleri ile değerlendirildi. İstatistikler One-way ANOVA testi ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. Bulgular: Uygulanan ilaçların % TUNEL indeksleri hesaplandığında ilaç uygulaması yapılan gruplarda kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı artış gözlendi. Anti-TLR2, anti-TLR4, anti-MyD88, anti-NFκB ve anti-PI3K primer antikorlarının immünoreaktivite şiddetlerinin ve hesaplanan H-Skor değerlerinin ilaç uygulaması yapılan gruplarda kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı azalma gözlendi. Western Blotting yöntemi ile de TLR2, TLR4, NFκB ve PI3K moleküllerinin varlığı gösterildi. Sonuç: Farklı metastatik potansiyel özellikleri olan 67NR ve 4T1 meme kanser hücre hatlarında; PI3K inhibitörü Wortmannin ile anjiyogenez inhibitörü Talidomid'in 24 ve 48 saatlik uygulamalarının TLR sinyal yolağı ve ilişkili moleküller üzerinde etkili olduğu ilk kez bu çalışma ile gösterilmiştir.
Normal endometriyum, endometriyal hiperplazi ve endometriyum kanserlerinde EZH2 proteininin moleküler yöntemlerle değerlendirilmesi
Amaç: Bu çalışmada, malignite açısından iki farklı insan endometriyum kanser hücre hatları ile normal endometriyum, endometriyal hiperplazi ve endometriyum kanserlerinde Enhancer of Zeste Homolog-2 (EZH2)'nin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: İnsan endometriyum kanseri hücre hatları Ishikawa ve MFE-319 (ACC-423) ile; normal endometriyum (proliferasyon ve sekresyon evresi); endometriyal hiperplazi (basit atipisiz ve kompleks atipili) ve endometriyal adenokarsinom (Tip I ve Tip II) örneklerinde EZH2 proteininin indirek immunohistokimyasal ve Western blotting yöntemleri ile değerlendirilmesi yapılmıştır. TUNEL yöntemi ile % apoptotik indeksler belirlenmiştir. EZH2 proteininin immunoreaktivite boyanmaları hafif (1), orta (2), şiddetli (3) ve çok şiddetli (4) olarak belirlenmiştir. Boyanan hücre sayıları % olarak sayılıp, boyanma şiddetleri ile H–skor elde edilerek, sonuçlar One-way ANOVA istatistiksel testi ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. P<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Bulgular: Çalışmada, malignite açısından farklı iki insan endometriyum kanser hücre hattı EZH2 immunoreaktivitesi açısından karşılaştırmalı olarak değerlendirildiğinde; agresif olan MFE-319 insan endometriyum hücre hattında çok şiddetli (4) gözlenirken, Ishikawa hücrelerinde hafif/orta (1/2) olarak izlenmiştir (p<0,05). Histopatolojik değerlendirmenin ardından endometriyum örneklerinde EZH2 immunoreaktivitesi değerlendirildiğinde, normal endometriyumdan hiperplaziye geçiş ve endometriyal hiperplaziden karsinogeneze geçiş süreçlerinde istatistiksel olarak anlamlı artmış EZH2 immunoreaktivitesi izlenmiştir. % TUNEL indeksleri değerlendirildiğinde kanser gelişiminin ileri evrelerinde TUNEL pozitif hücre sayılarında istatistiksel olarak anlamlı artış olduğu belirlenmiştir. Western Blotting yöntemi ile EZH2 proteini varlığı insan endometriyum kanser hücre hatlarında saptanmıştır. Sonuç: Malignite yönünden farklı iki farklı insan endometriyum kanser hattında ve normal endometriyumdan, endometriyal hiperplaziye ve karsinogenez sürecinde EZH2 proteininin prognostik faktör ve kanser tedavisinde hedef molekül olarak önemi ortaya konulmuştur.
Trofoblastik hücre ürünlerinin oosit kültüründeki yeri
Amaç: Çalışmamızda elde edilecek trofoblastik hücre ürünlerinin oosit kültüründe kullanılması ve oosit matürasyonuna olası etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda 14,5 günlük gebe farelerden enzimatik işlem sonucunda trofoblast kök hücreleri elde edildi. Ardından kültür işlemi için profaz I, metafaz I ve metafaz II oositler dişi farelerden elde edilerek M2 kültür vasatı, trofoblast kök hücre kültür vasatı (CM) ve trofoblast kök hücreleri (TR) ile 48 saat kültüre edildikten sonra her gruptan oositler immunoflouresan boyama ile anti-APC, anti-MAD1, anti-MAD2, anti-RAS, anti-MPF ve anti-Siklin B1 immunoreaktivitesinin tespiti ve DNA metilasyon analizi için ayrıldı. Bulgular: Trofoblast kök hücreleri plasentadan elde edilerek sitokeratin-7 pozitif olmasıyla karakterizasyonu yapıldı. Profaz I, metafaz I ve metafaz II aşamalarında toplanan oositlerin M2, CM ve TR kültür ortamında kültürleri sonrasında APC immün reaktivitesinin en fazla TR profaz I grubunda, MAD1 immünoreaktivitesinin TR grubunda metafaz II'de olduğu ve diğer gruplarda daha erken dönemde pozitiflik gösterdiği saptandı. MAD2 immunreaktivitesi ise en fazla CM grubunda, RAS immunoreaktivitesi en az TR grubunda iken diğer gruplarda beklenen şekilde idi. Siklin B1 immünreaktivitesi tüm gruplarda az iken MPF immünoreaktivitesinin özellikle CM grubundaki tüm oositlerde ve M2 grubundaki metafaz II oositlerde olduğu saptandı. DNA metilasyonunun en fazla M2 metafaz II oositlerde olduğu bunu CM grubundaki metafaz II oositin takip ettiği gözlendi. Sonuçlar: Çalışmada ana bilim dalımızda plasentadan ilk defa trofoblast kök hücre eldesi protokolü geliştirilmiş ve karekterizasyonu yapılmıştır. Elde edilen oositlerin kültürleri sonrasında CM kültür vasatının RAS, MPF ve MAD2 ekspresyonlarındaki artışa, APC ve siklin B1 ekspresyonundaki azalmaya sebep olmasından dolayı in vitro oosit maturasyonu kültürü açısından uygun olabileceği sonucuna varıldı.
Periferik sinir hasarından sonra zonisamide ve diklofenak sodyum kombine tedavisinin sinir rejenerasyonu üzerine etkileri
Periferik sinir hasarı (PSH), dünyada bir milyondan fazla insanı etkileyen önemli bir sağlık sorunudur. Mikrocerrahi tekniklerinin yaygınlaşması, histolojik ve immünohistokimyasal yöntemlerin ilerlemesi, sinir onarımının başarısını büyük ölçüde artırmıştır. Bununla birlikte, PSH sonrasında nöroprotektif bir madde olan zonisamide ile antienflamatuvar diklofenak sodyumun kombine uygulanmasının etkilerini araştıran bir çalışmaya literatürde rastlanmamıştır. Bu çalışmada, siyatik sinirde ezilme tipi bir yaralanma oluşturulduktan sonra, zonisamide ve diklofenak sodyum tedavisinin ayrı ayrı ve kombine tedavilerinin sinir rejenerasyonu üzerindeki etkilerinin ultrastrüktürel, immünohistokimyasal, histomorfometrik ve moleküler yöntemlerle araştırılması amaçlandı. Wistar cinsi 84 erkek sıçan randomize olarak, cerrahi işlem uygulanmayan kontrol grubu, siyatik sinirin açığa çıkarılıp hasar oluşturulmadan kapatıldığı sham operasyon grubu, hasar oluşturulduktan sonra herhangi bir tedavi uygulanmayan deney kontrol grubu, siyatik sinirde hasar oluşturulduktan sonra 7 gün boyunca günde 1 kere intraperitonal 2 mg/kg dozunda diklofenak sodyum verilen tedavi grubu, hasar sonrası 7 gün boyunca günde 1 kere oral gavaj ile 100 mg/kg dozunda zonisamide verilen tedavi grubu, hasar sonrası 7 gün boyunca intraperitonal 2mg/kg dozunda diklofenak sodyum ve oral gavaj ile 100 mg/kg dozunda zonisamide verilen kombine tedavi grubu olmak üzere 6 gruba ayrıldı. Tedavilerin zamana bağlı etkilerini incelemek üzere deney ve tedavi gruplarından 7., 14. ve 21. günlerde sinir dokuları elde edildi. iNOS ve COX-2 ekspresyonunun, zonisamide ve kombine tedavi gruplarında deney kontrole oranla belirgin olarak azaldığı ve bu azalmanın en belirgin 21. günde olduğu görüldü. Miyelinli sinir lif sayısının, kombine tedavi gruplarında deney kontrol grubuna kıyasla anlamlı olarak arttığı görüldü. Krox-20 ekspresyon seviyesinin hasar sonrası azaldığı, zonisamide ve kombine tedavi gruplarında ise arttığı belirlendi. p75NTR ekspresyon seviyesinin kombine tedavi grubu 14. günde diğer tedavi gruplarına oranla anlamlı olarak arttığı, 21. günde ise en yüksek seviyesine ulaştığı görüldü. Tüm bulgular birlikte değerlendirildiğinde, deneysel PSH sonrası zonisamide ile diklofenak sodyum kombine tedavisinin enflamasyonu baskılayarak, aksonal büyümeyi ve yeniden miyelinizasyonu arttırarak periferik sinir rejenerasyonunu uyarabileceği, yapılacak daha ileri moleküler çalışmalarla tedavi protokollerinde yer alabileceği kanaatine varıldı.
İmplantasyonda adezyon moleküllerinin rolü
İmplantasyon, iki farklı organizma olan embriyo ve anne endometriyumu arasında gerçekleşen ve birbirini takip eden üç fazdan oluşan (uterusa geçiş, adezyon ve invazyon) biyolojik bir olaydır. Embriyo ve endometriyum arasındaki bu karşılıklı ilk sosyal ve fiziksel etkileşim, üreme tıbbının hala çözemediği bir paradokstur. İmplantasyonun en çok merak uyandıran yönü ise, ilk bakışta sadece iki organizmanın teması gibi düşünülse de, bugün bile hala hepsi çok net ortaya çıkarılamamış yüzlerce molekül ve mekanizmanın kontrolü altında oluştuğu gerçeğidir. Adezyon molekülleri bu konunun en ilgi çekici ve karmaşık yönünü temsil etmektedir. Bu çalışmanın amacı sıçan endometriyumlarında, reseptif ve implantasyon aşamasında rol alan adezyon moleküllerini ve implantasyona etkilerini araştırmaktır. Bu amaçla çalışma grubu olarak belirlenen (n=20) dişi sıçanlar gebeliklerinin 5., 6. ve 7. günlerinde sakrifiye edilmek üzere deneye alındı. Histolojik çalışmalar sonucu desidual reaksiyona ilk olarak gebeliğin 5. gününde rastlandı. Reseptif dönem olarak kabul edilen 6. gündeki, genişlemiş desidual reaksiyon alanlarında TGF-a, laminin, kollajen IV, fıbronektin, integrin oc3, av, pi yoğun olarak gözlendi. İmplantasyon dönemi olarak kabul edilen gebeliğin 7. gününde, endometriyum epitelinde ve trofoblast hücrelerinde laminin, oc3, pl, TGF-a, İL- İp ve TNF-a immünoreaktivitelerinin oldukça arttığı görüldü. Anti-adeziv molekül olan MUCl'in ise gebe olmayan normal uterus epitelinde çok yoğun bir reaksiyon gösterirken, gebeliğin 6. gününde azalarak 7. günde ise tamamen ortadan kaybolduğu tespit edildi. Sonuç olarak, gebeliğin 5. gününde desidualizasyonun henüz başlamış olduğu ve 6. günde bu alanda yoğun olarak gözlenen laminin, kollajen IV ve fibronektinin desidual hücrelerin proliferasyonunda önemli rol oynadığı kanısına varıldı. Normal uterusta kuvvetli eksprese edilen MUC1 molekülünün ise, 6. günde azalarak embriyonun tutunmasını sağlayan adezyon moleküllerinin açığa çıkmasını sağladığı ve bu açığa çıkan moleküllerden laminin, kollajen IV, fıbronektin, integrin a3, av ve Pl'in adezyon fazında önemli rol oynadığı, TGF-a, kollajen IV, IL-ip ve TNF-a' nm ise invazyon fazında fonksiyon gösterdiği ortaya çıkarıldı.
İmplantasyon sırasında uterusun JAK STAT profili
7 ÖZETHücre dışından gelen çok sayıda sinyal bir transmembran reseptörü olanJAK'lar tarafından alınarak, hücre içindeki STAT'lar (signal transducers andactivators of transcription) aracılığı ile DNA'ya iletilir ve hedef gen üzerindetranskripsiyonu başlatır. Çok sayıda farklı molekül tarafından kullanılan bir yolak farklıfonksiyonların gerçekleşmesinde önemli rol oynamaktadır. Daha önce yapılançalışmalarda implantasyon döneminde bazı JAK ve STATların eksprese edildiğitespit edilerek fonksiyonları tanımlanmıştır. Ancak bu konuda yapılan çalışmalaroldukça sınırlıdır. Bu çalışmada sıçanlarda oluşturulan implantasyon modelinde ,JAK1, JAK2, JAK3, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 ve STAT6 ekspresyonuincelenerek uterusta implantasyon dönemindeki JAK/STAT profilinin çıkarılması vemuhtemel fonksiyonlarının araştırılması amaçlanmıştır.MATERYAL METODDişi sıçanlar 3 gruba ayrıldı. Sıçanlara saat 15:00 civarında vajinal smearyapıldı. Smear hematoksilen eozin boyası ile boyandı. Östroz durumları belirlendi.Östroz da olan dişi sıçanlar bir gece uygun şartlarda kafeste çiftleşmeye bırakıldılar.Ertesi gün servikal sürüntüde sperm tespit yöntemi ile gebe olarak kabul edilenhayvanlar ayrı kafeslere alındı. Ayrı kafeslere alındıkları gün embriyonik gün E:0. günolarak kabul edildi. Embriyonik 4., 5., 6. günlerde sıçanlar sakrifiye edildiler.4. günsakrifiye edilen sıçanlar 4. gün olarak, 5.gün sakrifiye edilen sıçanlar 5. gün olarak ve6. gün sakrifiye edilen sıçanlar 6. gün olarak tanımlandı. Ve implantasyon bölgelerimakroskobik olarak belirlendikten sonra uterus piyesleri %10 formol solusyonunakonarak 24-48 saat bekletildiler. Dokular rutin doku takip protokolüne uygun olarakparafin blok haline getirildi. Bloklardan 5 mikronluk seri kesitler alındı. Bu kesitlerhematoksilen-eozin ve immunohistokimya tekniklerine göre JAK ve STATmonoklonal antikorları ile boyandı. Boyanan preparatlar ışık mikroskobu iledeğerlendirildi.BULGULARH-E ile boyanan preparatlar, gebelik günleriyle uyumlu doku değişikliklerigösterdikleri gözlemlendi. İmmünohistokimyasal boyamalar da JAK1'in 4. gündeimmunkompetant hücrelerde, 5. günde stromal ve immunkompetant hücrelerde 6.günde ise desidual alanda boyandığı gözlendi. JAK2'nin tüm gruplarda kuvvetli65boyandığı, 5. günün bir önceki güne göre daha fazla boyandığı tespit edildi. JAK3'ünise JAK1 ile benzer boyanma özelliğinde olduğu, 5. ve 6. gün boyanmalarının 4.güne kıyasla artmış olduğu bulundu. STAT2 tüm gruplarda kuvvetliboyanmıştı,boyanma özellikle 4. gün boyaması 5 ve 6. günlere oranla daha çoktu.STAT3'le boyanan kesitler değerlendirildiğinde 4. 5 güne ait kesitlerde,antimezometriyal bölgede supepitelyal alanda, hafif bir boyanma izlenirken 6. gündeboyanmanın daha az olması dikkat çekici bulundu. STAT4 antikoru ile boyanandokuların zayıf bir immunreaktivite gösterdiği bulundu. STAT5 ile boyanan kesitlerde4. ve 5. günlerde yüzey epitel, stromal hücreler ve bezlerle birlikte immunkompetenthücrelerde güçlü immunreaktivite gözlendi, 6. günde ise desidual hücrelerde güçlüimmunreaktivite tespit edildi. STAT6 ile boyanan kesitler incelendiğinde 5. gündezayıf bir boyanma gözlendi.SONUÇJAK ve STAT'ların implantasyon dönemindeki profillerinin incelendiği buçalışmada, JAK ve STAT'ların uterustaki miktarları ve dağılımları günlere görefarklılıklar göstermektedir. Özellikle JAK2, STAT2, ve STAT5'in fazla salgılanması bufaktörlerin implantasyon döneminde aktif fonksiyon gösterdiklerinin bir belirtisi olarakdeğerlendirildi. Buna karşılık diğer faktörlerin az boyanması da bir takım supresiffonksiyonların belirtisi olarak değerlendirildi. Sonuç olarak gebeliğin başlangıçdöneminde JAK ve STAT'ların bazıları indukleyici bazıları ise baskılayıcı fonksiyongöstererek uterusun implantasyonu kolaylaştırma reaksiyonlarında önemli roloynamaktadır.66
Farklı deneysel testis iskemilerinin apoptozis ile histolojik ilişkisi
Ligasyon ile arteriyal dolaşımın bozlulmasına bağlı iskemi torsiyon ile buna venöz dolaşımın da eklenmesi 2 farklı mekanizma olarak birçok farklı klinik durumun deneysel olarak araştırılmasını sağlar. Bu çalışmada 6 saatlik isklemi sonrasında reperfüzyona bağlı hasarın zaman bağımlı histolojik incelemesi yapılarak oluşan oksidatif stres ve gelişen apoptozis ilişkisi araştırıldı.Erişkin sıçanlarda 6 saatlik torsiyon veya ligasyon iskemisini takiben 1, 3, 7 ve 28 günlük reperfüzyon uygulandı. İskemik reperfüzyon sonrası testis dokusu histolojik, immunohistokimyasal ve morfometrik olarak incelendi. Doku örnekleri Hematoksilen Eozin ve NOS antikorları ve TUNEL immunohistokimyası teknikleri ile boyandı. Sıçanların sağ testislerine iskemi uygulaması yapılıp ipsilateral grubu oluştururken sol testisleri kontralateral grubu olmak üzere değerlendirildi. Testisten alınan doku örneklerinde hasarın derecelendirilmesi, hücre ölümü, oksidatif stres ve apoptotizis körleme yöntemle germ hücrelerinin mikroskop altında histolojik ve morfometrik bakıları yapıldı.İskemik gruba ait testislerin seminifer tübüllerindeki spermatogonium,primer spermatosit ve spermatidlerdeki bozulma, germ hücre sayısında vakuolizasyon ve sayısal azalmanın torsiyon grubu ile karşılaştırıldığında ligasyon grubunda çok daha az olduğu görüldü. Bununla uyumlu bir şekilde NOS artımının varlığı ve apoptosizle ilişkili olduğu saptandı. Apoptozis bütün hücre tiplerinde gözlemlendi. Kontralateral testislerde çok daha az olmak üzere benzer bulgulara rastlanıldı.Bu bulgular iskemik reperfüzyona bağlı hasar oluşmasında torsiyonun venöz dönüşü de bozması nedeniyle daha etkin olduğunu ve iskemi dışında gelişen diğer faktörlerin torsiyon grubunda oluşan okidatif stres ve apoptozisi artırdığı düşünüldü.Anahtar kelimeler: testis, germ hücresi, torsiyon, ligasyon, iskemi, oksidatif stres, NOS, apoptozis
Deneysel testiküler torsiyon/detorsiyon modelinde nimodipin'in etkilerinin incelenmesi
Amaç: Testis torsiyonu (TT), spermatik kord ve içeriğinin kendi etrafında dönmesi sonucu oluşan, akut skrotumun en önemli nedenlerinden birisidir. TT sonrası iskemik hasar, detorsiyon sonrasında ise reperfüzyon hasarı oluşabilmektedir. İskemi ve reperfüzyon (İ/R) hasarını önlemek için birçok çalışma yapılmıştır. Literatürde kalsiyum kanal blokörü olan nimodipinin over ve karaciğerde İ/R hasarı üzerine etkilerini araştıran çalışmalar mevcut olup TT'deki etkilerini ultrastrüktürel düzeyde inceleyen bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Çalışmamızda, nimodipinin deneysel testiküler torsiyon/detorsiyon modelinde tedavi edici olası etkilerinin araştırılması amaçlandı. Gereç ve Yöntem: 250-300 gr ağırlığında, 40 adet Wistar-Albino türü erkek sıçan, 5 gruba (n=8) ayrıldı; Sham grubu, testis torsiyon grubu (TT), testis torsiyon/detorsiyon grubu (TT/D), testis torsiyon+nimodipin uygulanan grup (TT/N), testis torsiyon/detorsiyon+nimodipin uygulanan grup (TT/D/N). Sakrifikasyondan önce sıçanlardan alınan kan örneklerinde SOD aktivitesi, serum MDA ve testosteron analizleri yapıldı. Elde edilen testis doku örnekleri ışık ve elektron mikroskobik incelemeler için hazırlandı. Ayrıca testis doku kesitlerinde, apopitotik markır olan kaspaz-3 ve inflamasyon markırı olan TNF-α ekspresyonları immünohistokimyasal yöntemlerle araştırıldı. Bulgular: Işık mikroskobik olarak TT ve TT/D gruplarında tunika albugineada kalınlaşma, seminiferöz tübüllerde dejeneratif, litik ve apopitotik değişiklikler, interstisyel alanda ödem ve kanama izlendi. Elektron mikroskobik düzeyde, TT ve TT/D gruplarında bazal lamina ile membrana propriada kalınlaşma ve düzensizlik, seminiferöz tübül epitelinde bazal laminadan ayrılma, hücreler arası mesafede genişleme ve apopitotik cisimcikler, Sertoli hücrelerinde dejeneratif değişiklikler, okludens tipi bağlantıların yapısında bozulma, mitokondriyonlarda ve endoplazmik retikülüm sisternalarında genişleme, lipid damlacıklarında ve lizozom sayısında artış olduğu gözlendi. Spermatojenik seri hücrelerinde de mitokondriyonlarında ve endoplazmik retikülüm sisternalarında genişleme görüldü. İnterstisyel alanda ekstravasküler eritrosit varlığı, hücrelerarası alanlarda genişleme, Leydig hücre yapısında dejeneratif değişiklikler izlendi. T/D grubunda daha fazla olmak üzere inflamatuvar hücre artışı dikkati çekti. Nimodipin tedavisi uygulanan gruplarda (TT/N ve TT/D/N) ise, ışık ve elektron mikroskobik düzeyde nispeten normale yakın bir morfoloji gözlendi. TT ve TT/D gruplarında, kaspaz-3 ve TNF-α immünreaktivitelerinde artış, TT/N ve TT/D/N gruplarında ise azalma gözlendi. TT ve TT/D gruplarında serum MDA konsantrasyonlarında artış, SOD aktiviteleri ve serum testosteron konsantrasyonlarında azalma görüldü. TT/N ve TT/D/N gruplarında ise SOD aktiviteleri ve serum testosteron seviyelerinde hasar grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artma gözlenirken, serum MDA konsantrasyonlarında azalma görüldü. Sonuç: Bütün bulgular birlikte değerlendirildiğinde; TT ve TT/D gruplarında meydana gelen yapısal değişiklikler ve biyokimyasal bozulmalar üzerine nimodipin tedavisinin iyileştirici etkiler gösterdiği ve testis İ/R hasarında alternatif tedavi ajanı olarak kullanılabileceği sonucuna varıldı. Ancak bu tedavinin moleküler mekanizmaları ile ilgili daha fazla bilgi edinmek, doz ve süre düzenlemeleri yapılabilmesi için daha fazla deneysel ve klinik çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar kelimeler: Testiküler torsiyon/detorsiyon, nimodipin, kalsiyum kanal blokörü.
Global beyin iskemisi ile oluşan metabolik bozukluğun akciğerde yaptığı histopatolojik değişikliklerin oksidatif stres ve apoptosis ile ilişkisi
Beyin iskemisi ve takip eden reperfüzyon sonrasında önemli doku hasarı gerçekleşir. Bu hasara bağlı sistemik etki sonucunda oluşan metabolik değişiklikler; birçok farklı organda yeni mekanizmalar ile ortaya çıkmaktadır. Bu organların önemli bir tanesi akciğer olup, hücrelerden salınan serbest oksijen radikalleri reperfüzyon sonrasında meydana gelen hasarda önemli rol oynarlar. Çalışmamızın amacı: İki taraflı karotid arter oklüzyonu yöntemi ile oluşturulan deneysel beyin iskemisinde, ortaya çıkan solunumsal asidoza bağlı olarak değişen metabolik durumun, reperfüzyon sonrası hasarın kritik belirleyicisi olmasına katkısının araştırılması ve oksidatif stres ile apopitoz birlikteliğinin incelenmesidir.Çalışmamızda erişkin erkek Wistar sıçanlar (250 ± 50 gr) her grupta 5 hayvan ve 4 grup olacak şekilde kullanıldı. 10 dakikalık ön tanıtım (ÖT) iskemisini takiben 48 saat sonra 20 dakika süreyle global iskemi (Gİ) uygulandı. İskemik reperfüzyon (İR) etkisi için Gİ sonrası 48 saatlik süre beklendi. İskemi uygulaması öncesi ketamin + ksilazin anestezisi altında, femoral arter yolu ile hem hipovolemi oluşturmak hem de kan gazı analizi yapmak üzere 10 ml kan alındı. Kontrol amaçlı taklit grubunda (SH) ligasyon sonrasında iskemi yapılmadı. Sıçanların tamamı 96 saatlik toplam süre sonrasında incelenmek üzere öldürüldü. Tüm gruplar için deneklerin optik kiezma sınırından kesitleri alınarak beyinleri hippokampus düzeyinde histokimyasal (H-E), immünohistokimyasal (GFAP, S100ß, iNOS, eNOS, TUNEL) ve morfometrik analizler ile değerlendirilen hayvanların akciğerleri hilus düzeyinde alınan kesitlerde benzer yöntemler (H-E, MT, iNOS, eNOS, TUNEL) ile incelendi.Beyinde iskemi sonrasında gruplar arasında görülen anlamlı histopatolojik değişikliklerin gliosize (GFAP, S100ß) ile gelişen oksidatif strese (iNOS, eNOS) ve ilişkili apopitoze (TUNEL) neden olduğu saptandı. Akciğer histopatolojik hasarı, histolojik parametreler ile morfometrik olarak belirlendi. SH ile ÖT grupları arasında minimal değişiklikler bulundu. Ancak bu gruplar, global iskemi ve iskemi reperfüzyon gruplarından hasar açısından anlamlı olarak farklı idi. Buna karşılık Gİ ve İR sonrası anlamlı bir akciğerde uzak organ etkisi şeklinde gelişen hasarın varlığı görüldü. Hasarın H-E incelemesinde değişen derecelerde interstisyel ödem, vasküler konjesyon, intraalveoler kanama, kan damarları etrafında ödem, nötrofil infiltrasyonu ve alveol yapısında bozulma şeklinde saptandı. Ayrıca Masson Trikrom boyamasında bağ dokuda inflamatuar hücreler rastlandı. Akciğerde oluşan hasarın beyinde gerçekleşen hasara benzer şekilde oksidatif strese bağlı oluşan serbest radikaller (iNOS, eNOS) ile ilişkili olduğu ve TUNEL yöntemi ile belirlenen apopitozun indüklenmesine ve hücre ölümünün aktifleşmesine neden olduğu bulundu.Sonuçlarımız beyinde gelişen iskemi ve reperfüzyon hasarında akciğerde uzak organ etkisi şeklinde oluşan histopatolojik değişikliklerin hücresel infiltrasyona bağlı serbest oksijen radikallerinden kaynaklandığını ve bir mekanizma olarak apopitozu indükleyerek hücre ölümüne neden olduğunu göstermektedir.Anahtar kelimeler: Beyin, İskemi, Reperfüzyon, Akciğer, NOS, Apopitoz