Farklı inkübasyon koşulları ve stres faktörlerinin mikrobiyal transglutaminaz üretimine etkisi, enzimin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu

Bu çalışmada, transglutaminaz (TG) enziminin faklı türlerden mikrobiyal olarak üretilmesi, fermantasyon koşullarının geliştirilmesi, enzim üretimine etki eden stres faktörlerinin belirlenmesi, enzimin farklı yöntemler ile kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Streptomyces mobaraensis (NRRL B-3729) türü kullanılarak 30°C'de pH 6.0'da nişasta-glukoz bazlı besiyerinde (GNB) mikrobiyal transglutaminaz (mTG) enzim üretimi (0.036 Ünite/ml) başarılı bir şekilde sağlanmıştır. Aynı koşullarda çalkalamalı (orbital) inkübasyonda enzim aktivitesinde ~3.75 katlık bir artış sağlanmış ve ayrıca üretim süresi kısaltılmıştır. Ayrıca, daha etkin bir karıştırma ve havalandırmanın sağlandığı kontrollü fermantasyonda (500 rpm, 10 cm3 hava/dak) 0.423 Ünite/ml değerinde aktiviteye ulaşılarak çalkalamalı inkübasyona göre enzim aktivitesinde 3.13 kat, statik inkübasyona göre ise 11.75 kat artış sağlanmıştır. Enzim üretimine stres faktörlerinin etkisi incelenmiş ve kullanılan tüm tuz çeşitleri ve tripsin enzimi aktivitede önemli bir artış sağlamıştır. Üretilen mTG enziminin kısmi saflaştırma basamağında, %80 amonyum sülfat tuz doygunluğunda gerçekleştirilen çöktürme işleminde verim %93 ve saflaştırma katsayısı 1.18, %80 etanol konsantrasyonunda ise verim %98 ve saflaştırma katsayısı 1.00 olarak belirlenmiştir. Amonyum sülfat çöktürme ve diyaliz işlemleri sonrasında elde edilen ~37 kDa moleküler ağırlığa sahip kısmi saflaştırılmış enzimin kinetik parametreleri belirlenerek Michaelis sabiti (Km) 6.35 mM, maksimum hızı (Vmax) 0.35 Ünite/ml olarak hesaplanmıştır. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı 37°C ve pH'sı 5.8 olarak belirlenirken, pH 6.0'da 55°C'de stabilitesini yüksek oranda koruduğu (~%93) gözlenmiştir. Bazı metal iyonları (Fe+2, Co+2, Zn+2) varlığında mTG enzimi aktivitesinde kayıplar meydana gelirken, EDTA bulunan reaksiyon ortamında aktivitede artış gözlenmiştir. Bu sonuçlar farklı fermantasyon stratejilerinin kullanılarak mTG enzim üretiminde artış sağlanabileceğini göstermektedir ve saflaştırılan enzimin karakterizasyonunun bu tür enzimlerin endüstrideki uygulama alanlarında kullanılabilirlilikleri açısından önem arz etmektedir.