Farklı klı̇nı̇k kaynaklardan ı̇zole edı̇len Klebsıella pneumonıae'nın çekirdek algılayıcı genlerı̇nı̇n moleküler tespı̇tı̇

Klebsiella pneumoniae önemli bir patojenik Gram-negatif, motil olmayan bakteridir. Bakteri, sağlıklı insanların burun boşluğunda, boğazında, gastrointestinal sisteminde ve cildinde asemptomatik olarak barınabilen fırsatçı bir patojen olarak kabul edilir. İdrar yolu enfeksiyonları (İYE), pnömoni, bakteriyemi, pürülan karaciğer apseleri ve yara enfeksiyonları dahil olmak üzere birçok yaygın hastalıktan sorumludur. Bu çalışmanın amacı, farklı klinik kaynaklardan izole edilen çoklu ilaç dirençli Klebsiella pneumoniae bakterilerinin izolasyonu ve karakterizasyonu, biyofilm ve quorum sensing genlerinin tespiti ve gümüş nanopartiküllerin bu genlerin gen ekspresyonları üzerindeki etkisini incelemektir. Çalışma Eylül 2021-Eylül 2022 tarihleri arasında yürütülmüştür. Balgam, idrar ve yara kaynaklarından izole edilen 150 klinik Klebsiella pneumoniae suşu, MacConkey agar besiyerinde 37℃'de 24 saat boyunca kültürlenmiştir. İzolatı tanımlamak ve antibiyotik duyarlılığını tespit etmek için VITEK-2 kompakt sistemleri kullanılmıştır. Biyofilm oluşturma yeteneği 96 kuyulu mikroplaka yöntemi ile belirlenmiştir. Çekirdek algılama geni (LuxS), biyofilm oluşturma geni (mrkD), Efflux geni (AcrAB), Hızlı Amplifiye Polimorfik DNA (RAPD) Analizi ve Enterobakteriyel Tekrarlayan İntergenik Konsensüs (ERIC) Analizi genlerinin varlığı ve ekspresyonu için değerlendirme PCR ve RT-PCR ile yapılmıştır. Gümüş nanopartiküllerin toksisitesi bir hemoliz deneyi ile test edilmiştir. Klebsiella pneumoniae klinik suşları balgamın %50'sinden, idrarın %43,33'ünden ve yaraların %6.66'sından izole edilmiştir. Suşlar Genişlemiş spektrumlu beta laktamazlara (GSBL) %77, Gentamisin'e %67, Sulfametoksazol/Trimetoprim'e %65, Amoksisilin-klavulanik aside %55, Ampicillin %39, Cefotaxime %39, Ceftazidime %39, Cefixime %36, Piperacillin/Tazobactam %33, Meropenem %29, Ciprofloxacin %29, Imipenem %13 ve Amikacin %13 direnç göstermiştir. Tüm suşlar biyofilm oluşturabilmiş, toplam 150 izolattan %13'ünün güçlü biyofilm üreticisi, %40'ının orta düzeyde biyofilm üreticisi ve %47'sinin zayıf biyofilm üreticisi olduğu görülmüştür. Nükleik asit konsantrasyonu ve saflık sonuçları Qubit florometre kullanılarak belirlenmiştir. Analiz edilen örnekler 20 güçlü biyofilm üreticisi izolattan, 20 orta derecede biyofilm üreticisi izolattan ve 20 zayıf biyofilm üreticisi izolattan elde edilen DNA ve RNA'yı içermektedir. Nükleik asitlerin ortalama konsantrasyonları (21,95±1,30), (15,16±1,55), (23,33±3,23) olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, nükleik asitlerin saflığı 260nm/280nm'deki spektrofotometrik emilim oranı olarak hesaplanmış ve üç biyofilm üreten kategori için (1,85±0,08), (1,92±0,02), (1,90±0,02) olarak ortaya çıkmıştır. RAPD PCR, üç gruptan rastgele ve eşit olarak seçilen otuz örneğin DNA düzeyinde genetik polimorfizmin belirlenmesine adanmıştır, mevcut çalışmada RAPD analizini gerçekleştirmek için OP-V02, OP-V09, OP-V14, OP-V19 ve OP-V04 olmak üzere beş primer kullanılmıştır. Belirli bir primer ile PCR amplifikasyonu ve elde edilen amplifikasyon bantlarının elektroforezinden sonra, sonuçlar bandın varlığını gösteren (+) ve bandın yokluğu anlamına gelen (-) olarak belirlenmiştir. ERIC PCR için üç gruptan rastgele ve eşit olarak otuz örnek seçilmiştir. ERIC profilleri Dice benzerlik matrisi katsayısı kullanılarak karşılaştırılmış ve filogenetik ağacı hazırlamak için komşu-birleştirme yöntemiyle kümelenmiştir. ERIC bantlama paternlerinde iki veya daha fazla farklı banda sahip izolatlar farklı ERIC tipleri olarak kabul edilmiştir. Dendrogram kümelere göre çizilmiştir. ERIC-PCR, her bir güçlü biyofilm üreticisi K. pneumoniae izolatı için 175 ile 4000 bp arasında değişen boyutlarda bantlar içeren farklı bant desenleri oluşturmuştur. İzolat başına bant sayısı 3 ile 11 arasında değişmekte olup, bu durum izolatlar arasında önemli genetik çeşitlilik olduğunu göstermektedir. Orta derecede biyofilm üreticisi K. pneumoniae izolatlarında bant boyutu 175-2500 bp arasında değişmektedir. İzolat başına bant sayısı 3 ile 11 arasında değişmektedir ve bu da izolatlar arasında önemli genetik çeşitlilik olduğunu göstermektedir. Son olarak, çoğaltılan bantların boyutu 175 ile 4000 bp arasında değişmiştir. İzolat başına bant sayısı 4 ile 10 arasında değişmektedir; bu da zayıf biyofilm üreticisi K. pneumoniae için güçlü ve orta derecede biyofilm üreticisi izolatlara kıyasla daha az çeşitli bir genetik tabloya işaret etmektedir. Nanopartikül uygulamasının quorum sensing (LuxS) ve biyofilm oluşumunda rol oynayan (mrkD) genlerin ifade düzeyleri üzerindeki etkisini belirlemek için gerçek zamanlı bir PCR deneyi uygulanmıştır. Bu çalışmanın sonucu, LuxS geninin nanopartiküllerle muamele edilmeden önceki ortalama ∆∆ değerinin (0,142±0,46), aynı genin nanopartiküllerle muamele edildikten sonraki ortalama ∆∆ değerinden (0.102±0.68) istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediğini (p=0,61); aynı genin nanopartiküllerle muamele öncesi ve sonrası kat değişimleri karşılaştırıldığında da aynı karşılaştırmanın istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediğini (p=0,133) ortaya koymuştur. Bu çalışmanın sonucu, mrkD geninin nanopartiküllerin uygulanmasından önceki ortalama ∆∆ değerinin (0,68±0,23), aynı genin nanopartiküllerle muameleden sonraki değerinden (-0,03±0,34) istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde (p=0,063) farklı olmadığını ortaya koymuştur. Ancak, aynı genin nanopartiküllere maruz kalmadan önceki ve sonraki kat değişimleri karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p=0,049) görülmüştür. Gümüş nanopartiküllerin toksisitesi bir hemoliz deneyi ile test edilmiştir. Hemolizin eşlik ettiği 500 mg/mL gümüş nanopartikül çözeltisi %0,033 olarak ortaya çıkmıştır; bu da gümüş nanopartiküllerin hemolitik olmadığı ve biyouyumlu olduğu anlamına gelmektedir. Bu çalışma Klebsiella pneumoniae klinik izolatlarının antibiyotik direnci ve biyofilm oluşturma yetenekleri hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. GSBL'ler %77, Gentamisin %67 ve Sulfametoksazol/Trimetoprim %65 olmak üzere yüksek direnç oranları gözlenmiştir. Meropenem (%29) ve Imipenem (%13) gibi karbapenemlere karşı direnç de kaydedilmiş olup, bu durum tedavideki zorlukları vurgulamaktadır. Tüm izolatlar biyofilm oluşturmuş olup, %13'ü güçlü üretici, %40'ı orta düzeyde üretici ve %47'si zayıf üretici olarak patojenin kalıcılığını ve virülansını vurgulamaktadır. RAPD ve ERIC-PCR analizleri, izolatlar arasında, özellikle de güçlü ve orta derecede biyofilm üreticilerinde önemli genetik çeşitlilik olduğunu ortaya koymuştur. Gümüş nanopartiküller biyofilmle ilişkili mrkD geninin ekspresyonunu azaltmada istatistiksel olarak anlamlı bir etki gösterirken LuxS gen ekspresyonu etkilenmemiştir. Nanopartiküller biyouyumludur ve test edilen konsantrasyonda ihmal edilebilir hemoliz sergilemektedir. Bu çalışma, çoklu ilaca dirençli K. pneumoniae'nin oluşturduğu halk sağlığı tehdidinin ve gümüş nanopartiküllerin biyofilmle ilişkili virülansı azaltmak için yardımcı bir strateji olarak potansiyelinin altını çizmektedir