Fibrinolitik lumbrokinaz enziminin filamentli mantar Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması

Bu çalışmada lumbrokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de yüksek verimde üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmektedir. Bu enzim fibrinolitik etkiye sahip olduğundan dolayı birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Homolog üretim kaynağı lumbrokinaz için Lumbricus bimastus (283 aa)'dır. Homolog olarak üretimlerinin kısıtlı, zaman alıcı ve pahalı olması sebebiyle araştırmacılar bu enzimin heterolog çalışmalarına yönelmiştir. Fakat farklı ekspresyon sistemlerinde üretilme çalışmalarına rağmen yeterli ve istenilen verimde üretimi sağlanamamıştır. A. oryzae, amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretme yeteneğine sahiptir. Bu özellik sayesinde A. oryzae homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. A. oryzae'nin güçlü protein salgılama, hızlı büyüme, kolay kültüre ve optimize edilebilme özelliklerinden dolayı bu çalışmada ekspresyon sistemi olarak seçilmiştir. C-terminaline 6X His-tag etiketlenmiş ve Aspergillus oryzae'ye kodon optimize şekilde tasarlanmış lumbrokinaz enzimi, pUC19 plazmid vektörüne ligasyon yapılarak sentezlettirilecektir. Gelen vektörün önce Escherichia coli TOP10 hücrelerine transformasyonu, daha sonra protoplast yöntemi ile A. oryzae'ye transformasyonu yapılacaktır. Daha sonra, CD Agar plaklarına ekimi yapılarak koloni seçilecek ve seçilen koloniler daha spesifik koloniler ve protein salınımları için DPY besiyerine ekilecektir. SDS PAGE ile kontroller sağlanacak ve bir koloni seçilerek ekspresyon başlatılacaktır. Proteinlerin saflaştırılması için IMAC (İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi) metodu kullanılacaktır.