Floresan protein temelli fret biyosensörünün üretilmesi ve geliştirilmesi

Förster veya Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), iki florofor arasında meydana gelen radyoaktif olmayan enerji transferi olarak tanımlanmaktadır. FRET biyosensörlerinde, küçük organik boyalar, floresan proteinler ve kuantum noktacıklar olmak üzere üç ana tipte florofor kullanılmaktadır. Floresan proteinler, genetik olarak kodlanabilmesi ve hücrelerle uyumlu olmasından dolayı yaygın şekilde kullanılmaktadır. Floresan Protein temelli FRET (FP-FRET) biyosensörleri, enzim aktivitesi, hücre içi iyon konsantrasyonu, konformasyonel değişimler, protein-protein etkileşimleri gibi biyolojik süreçlerin görüntülenmesinde kullanılmaktadır. Sunulan tez çalışması ile proteaz aktivitesinin FP-FRET biyosensörü yardımıyla tespit edilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, TEV proteaz enzimi model olarak seçilmiştir. mClover3-mRuby3 ve mNeonGreen-mRuby3 floresan çiftlerini içeren FRET biyosensörlerine ait plazmitlerin tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan FP-FRET biyosensörüne ait genin ekspresyonu, rekombinant DNA teknikleri kullanılarak E. coli DH5α hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Ekspresyonu gerçekleştirilen füzyon protein, afinite kromatografisiyle saflaştırılmıştır. Sonuç olarak, TEV proteaz enziminin aktivitesi üretilen FP-FRET biyosensörü kullanılarak spektroflorometre cihazında gerçekleştirilen emisyon ölçümleri ile tespit edilmiştir. Daha sonraki çalışmalarda, önemli biyolojik süreçlerde belirteç olarak kullanılan enzimlerin aktivite tayini için yeni FP-FRET biyosensörlerinin üretilmesi hedeflenmektedir.