Floresans ömür dağılımı kullanılarak poliakrilik asit-tripsin konjugatı ve serbest tripsinin proteolitik aktivitesindeki değişimlerin incelenmesi

Proteinlerin polimer konjugatları, kararlılıklarını arttırmak ve uygulama alanlarını genişletmek için sentezlenir. Amino, hidroksil, karboksil, fenol vb. grupları içeren bir dizi fonksiyonel grup enzimlerin kovalent konjugasyonu için kullanılır. Enzimleri sabitlemek için sentetik organik polimerler, biyopolimerler, hidrojeller, inorganik destekler ve akıllı polimerler de dahil olmak üzere birçok malzeme kullanılır ve bu uygulamalar sonucu iyi aktivite tutma ve gelişmiş termo kararlılık sıklıkla gözlemlenir. Bağlanacak polimerin kimyasal bileşimi ve fiziksel yapısı immobilize edilecek biyomakromolekülün mikro ortamını ve dolayısıyla biyolojik özelliklerini etkiler. Floresans ömür dağılım profilleri, polimerler ile konjugasyon sonucu enzim aktivitesindeki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Proteinlerin farklı bölgelerinde gömülü olan floresan gruplar farklı kimyasal ortamlara sahiptirler ve yapılarında yer aldıkları proteine özgün olarak çeşitlenen floresans ömür dağılım profilleri sergilerler. Bu dağılımların, proteazların serbest halleri ve polimer konjugatları etkisinde göstereceği değişimler arasındaki farklılıklar, protein substratın hidroliz süreci ve sentezlenen "Polimer-Proteaz" konjugatının aktivitesi ve kararlılığı hakkında faydalı bilgiler sağlayabilir. Proteinlerin denatürasyonuna son derece duyarlı olan eksimerlerle modifiye edilmiş protein substratlardan elde edilen floresans ömür dağılım profilleri, proteazların serbest halleri ile polimer konjugatları arasındaki proteolitik farklılıkları çok daha hassas olarak belirlemede kullanılabilir. Bu çalışmamızda; Tripsin enziminin serbest hali ile Poliakrilik asit konjugatının (PAA-Tripsin) proteolitik aktiviteleri arasındaki farklılıklar, bazik pH'da (pH:9) "N-(1-Pirenil)maleimid; (PM)" ile modifiye edilerek 464 nm civarında maximum eksimer emisyonu sergileme yeteneği kazandırılmış "Sığır Serum Albümin (Bovine Serum Albumin; BSA)"inin floresans ömür dağılımlarındaki değişimlerle incelendi. Konjugasyonun tripsin aktivitesinde önemli derecede azalmaya neden olması sonucu floresans spektrumunda eksimer emisyonunda dikkate değer bir değişim gözlemlenemedi; ancak, floresans ömür dağılımlarında büyük değişimler elde edildi. Bu sonuçlar, floresans ömür dağılımı analizinin; proteazların hidrolitik aktivitelerinin farklılıklarına göre belirlenmesinde ve birbirlerinden ayrıştırılmalarında son derece hassas bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.