İki kromatin faktörünün (USP22 ve MENIN) yeniden programlamada vepluripotensideki fonksiyonel rolleri

OCT4, SOX2, KLF4 ve C-MYC (OSKM) faktörlerinin anlatımı somatik hücreleri uyarılmış pluripotent kök hücrelere (uPKH) yeniden programlayabilir. Somatik hücre kimliğini koruyan hücre içi bariyerlerin olması sebebiyle somatik hücre yeniden programlanması düşük verimli bir süreçtir. Daha önce gerçekleştirilen CRISPR-Cas9 bazlı susturma taraması ile USP22 ve MLL1 genleri yeniden programlama bariyerleri olarak ortaya çıkarıldı. Bu tezin birinci bölümünde, USP22 geni susturulmuş hücre hatlarının üzerine yabanıl tip ve katalitik mutant USP22'nin tekrar anlatılmasıyla, yeniden programlamadaki değişimin USP22 kaybıyla ilgili olduğu ve bu etkinin USP22'un katalitik aktivitesinden bağımsız olduğu kanıtlandı. USP22'nin fibroblast hücre hatlarında susturulması ve bu hatların farklı 'primed' kültür koşullarında yeniden programlanması ile, artan yeniden programlama veriminin hücre hattı ve kültür koşullarından bağımsız olduğu kanıtlandı. Yeniden programlamanın belirli zamanlarında yapılan transkriptom analizi, USP22'nin susturulmasının COL1A2, POSTN, FOXC2 gibi somatik hücreye özgü genlerin yeniden programlama boyunca baskılanmasına yol açtığını ortaya çıkardı. Ek olarak, 3. gün gibi çok erken bir zamanda bile, USP22 kaybının SOX2, LIN28A gibi genel pluripotent genlerinin ve DNMT3L, GDF3, ALPPL2, ARGFX gibi 'naive' pluripotent genlerinin ifadesinin artmasına sebep olduğunu ortaya çıkarıldı. USP22'nin rolünün naive pluripotensiye ulaşmadaki rolünü araştırmak üzere somatik hücrelerden naive yeniden programlama deneyi yapıldı ve sonuç olarak TRA-1-60/KLF17 çift boyama ile belirlenen naive kolonilerin nicelik olarak arttığı gözlemlendi. Ek olarak, geçiş sırasındaki DNMT3L ve ALLPL2 gibi naive pluripotensi genlerinin anlatımındaki artıştan yola çıkarak USP22 kaybının primed pluripotensiden naive pluripotensisine geçişin verimliliğini arttırdığı ortaya kondu. İkinci bölümde, MEN1 geninin susturulmasının farklı fibroblast hücre hatlarında yeniden programlama verimini artırdığı gösterildi. H3K79me2 kromatin işaretini okuyamayan H433A nokta mutantı MENIN'in yeniden kurtarma deneylerinde kullanılmasıyla, MENIN'in yeniden programlamadaki bariyer fonksiyonunun kısmi olarak bu aktivitesiyle ilgili olduğu belirlendi. MEN1'in susturulmasının pluripotensiye etkisini kontrol etmek için, MEN1 geni susturulmuş fibroblastlardan tek klondan büyüyen uPKH hatları üretildi. Karakterizasyon deneyleri bu klonların endojen OCT4, SOX2 ve KLF4 genlerini ifade ettiklerini, aynı zamanda transgenik C-MYC genini susturulduğunu gösterdi. Ayrıca, bu klonların stabil olarak pluripotensi ile ilgili proteinleri ifade ettiği ve teratom oluşumu deneyine tabii tutulduğunda, üç embriyonik tabakadan dokulara farklılaşabildiği gösterildi. Son olarak, VTP50469 kimyasalı kullanarak MENIN-MLL1 Kompleksi inhibisyonunun fibroblast hücre hatlarında yeniden programlama verimini artırdığı gözlemlendi. Ek olarak, VTP50469 3-faktörlü (OSK) yeniden programlamanın verimini artırdı ve yalnızca 2-faktör (OS) kullanarak uPKH üretimine olanak sağladı. Sonuç olarak, bu çalışma 2 farklı kromatin faktörünün yeniden programlama ve pluripotensideki önemli rollerini göstermektedir.