Fusobacterıum nucleatum'un enolaz enzimini kodlayan genin klonlanması ve analizi

Fusobacterium nucleatum insanlarda periodontitis, gingivitis gibi periodontal hastalıklara neden olmaktadır. Ayrıca F. nucleatum oral mikrobiyomda bulunan yaygın türlerden biri olup, oral floradaki diğer bakteriler ve konak epitelyal hücreler ile etkileşmektedir. Fusobacteria'larda antibiyotik duyarlılığının rapor edilmesi, bu türe karşı alternatif ilaçların geliştirilmesi gerektiğini göstermektedir. Enolaz F. nucleatum'un glikolitik yolağındaki, 2- fosfogliserik asidin (2-PGA) fosfoenol pirüvata (PEP) dönüşümü reaksiyonundan sorumlu enzimdir. Bakterinin metabolizmadaki rolünden dolayı F. nucleatum'un enolaz enzimi bu çalışmada hedef molekül olarak seçilmiştir. F. nucleatum enolaz enzimi literatürde ilk defa izole edilmiş, klonlanmış, eksprese edilmiş, kinetik ve yapısal olarak analiz edilmiştir. F. nucleatum enolazı (FnENO) kodlayan gen ilk olarak pGEM®-T Easy Vektör sistemine klonlanmıştır. Daha sonra Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde enzimin ekspresyonunun yapılması için pLATE 31 vektörüne alt-klonlaması yapılmıştır. Ni-NTA agarozu kullanılan affinite kromatografisi ile protein saflaştırılmasını sağlamak için proteinin C- terminal ucuna 6xHis-tag bölgesi eklenmiştir. Protein saflaştırma işleminden sonra 46,37 kDa olan proteinin SDS-PAGE analizinde enzimin, % 95'in üzerindeki yüksek saflıkta elde edildiği gösterilmiştir. Bu enzimin kinetik karakterizasyonu öncesinde optimum pH ve termostabilite analizleri yapılmıştır. FnENO enziminin optimum pH'ı 8,5 olarak bulunmuştur ve spesifik aktivitesi 57,14 U/mg olarak hesaplanmıştır. Termostabilite analizleri FnENO aktivitesinin 30-60 0C arasında stabil kaldığını göstermiştir. Kinetik analiz pH 8,5 ve 250C'de yapılmıştır. Saflaştırılmış FnENO enziminin kinetik parametreleri GraFit 3.0 kullanılarak belirlenmiştir. Kinetik değerler, 2-PGA substratının kullanılmasıyla Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1 olarak elde edilmiştir. Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin homoloji modellemesi Enterococcus hirae enolazının yapısı kalıp alınarak oluşturulmuş ve muhtemel ilaç hedef bölgeleri tanımlanmıştır. Tüm bu sonuçlar yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı doğrultusunda yeni görüşler ortaya çıkarabilecek ve enolaz, insandaki Fusobacterium nucleatum enfeksiyonlarını baskılamak için aday olabilecektir. Anahtar kelimeler: Fusobacterium nucleatum, enolaz, periodontal hastalıklar, kinetik karakterizasyon, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı.