Geobacillus thermodenitrificans HBB268 lipazının saflaştırılması ve karakterizasyonu

Bu çalışma, Geobacillus thermodenitrificans HBB268 suşunun lipaz üretim kapasitesini optimize etmek, intrasellüler lipazın saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu sağlamak amacıyla yürütülmüştür. Lipaz üretimi üzerine besiyeri bileşenlerinin optimizasyonu PBD ve CCD istatiksel yöntemleri ile 18.27 g/L pepton, 18.41 g/L et ekstresi ve 1.26 g/L glikoz olarak belirlenmiş ve bu ortamda 18 saatlik inkübasyon sonunda maksimum 352 U/mL lipaz aktivitesine ulaşılmıştır. Saflaştırma adımlarında ilk olarak amonyum sülfat çöktürme yöntemi ile %60 doygunluk seviyesinde lipaz 3,05 kat saflaştırılmıştır. Devamında, lipaz Phenyl-Sepharose® CL-4B hidrofobik etkileşim kromatografisi ile 4 kat, Q Sepharose® iyon değişim kromatografisi ile 55 kat ve son olarak Bütil-Sepharoz kromatografisi ile 372 kat saflaştırılarak 5104.76 U/mL spesifik aktivite ölçülmüştür. . SDS-PAGE analizi, lipazın moleküler ağırlığını yaklaşık 55 kDa olarak tayin edilmiştir. Lipazın aktivitesi pH 7,00 ve 55 °C'de maksimum iken, stabilitesi pH 8,00-10,00 aralığında bazik ortamda sağlanmıştır. Kinetik analizler ile Vmax değeri 75,56 U/mL ve Km değeri 26,07 μM olarak belirlenmiştir, bu da enzimin p-nitrofenil laurat için yüksek substrat afinitesine sahip olduğunu göstermektedir. Lipaz aktivitesi +1değerlikli metal iyon varlığında büyük oranda korunmuştur. Ticari deterjanlarda Perwoll® %1 konsantrasyon lipaz stabilitesini anlamlı bir ölçüde korumuştur. Bunun yanında, lipaz deterjanla birlikte kullanıldığında pamuklu kumaşlardan yağ lekesi giderme etkinliğini düşük seviyede artırmıştır. Ayrıca, tiyol grubu indirgenlerinin lipaz aktivitesini artırdığı, tiyol grubu oksidanlarının ise aktiviteyi düşürdüğü gözlemlenmiştir. Lipazın aktif merkezinde katalizden sorumlu olan başlıca amino asitler sistein, triptofan ve serin olarak belirlenmiştir. Polihidrik alkollerden sorbitol lipazın termostabilitesini ve apolar çözücülerin lipazın stabilitesini arttırdığı gözlenmiştir.