Goose parvovirus (GPV) VP2 geni temelli rekombinant subunit proteinin üretilmesi

İlk kez 1960'lı yıllarda Avrupa'da Derzsy's hastalığı olarak tanımlanan Goose parvovirusu (GPV), su kuşu endüstrisinde büyük ekonomik kayıplara ve yüksek mortalitelere sebebiyet vermektedir. Bu nedenle hastalıkla mücadele noktasında korunma/kontrol hedeflerinin oluşturulması oldukça önemlidir. GPV genomu yaklaşık 5.1 kilobaz (kb) uzunluğunda olup iki açık okuma çerçevesi (ORF) içerir. Virüsün yapısal proteinleri olan VP1, VP2 ve VP3 aynı ORF'nin alternatif uçbirleştirme (splicing) mekanizmaları ile meydana getirilir. Bunlardan VP2 proteini en fazla ifade edilen protein olup konakçı immün yanıtını en güçlü şekilde uyaran proteindir. Bu nedenle tez çalışmasında, GPV'ye karşı rekombinant aşı veya hızlı test kiti geliştirilmesinde aday antijen olarak kullanılması hedeflenen VP2 proteininin Baculovirus ekspresyon vektör sisteminde (BEVS) üretilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla öncelikle GPV'ye yönelik spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR ile VP2 geninin amplifikasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen VP2 amplikonu saflaştırıldıktan sonra ticari pENTR™/TEV/D-TOPO™ entry vektörüne klonlandı. Daha sonra pENTR™/TEV/D-TOPO™ vektörü bünyesinde bulunan hedef gen, LR Rekombinasyonu aracılığı ile linear N-Term BaculoDirect™ DNA'sına aktarıldı. Oluşturulan bu yapı Spodoptera frugiperda (Sf9) insekt hücrelerine transfekte edilerek baculoviral virionlar elde edildi. VP2 geninin BaculoDirect™ Linear DNA'ya aktarılıp aktarılmadığını doğrulamak amacıyla hem VP2 genine hem ekspresyon vektörüne yönelik eksternal primer setleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonu sonucunda yaklaşık 600 bp uzunluğunda band elde edildi. Rekombinant protein üretimini doğrulamak amacıyla, üretilen proteinin N ucunda bulunan V5 epitopundan yararlanılarak Western Blot analizi yapıldı. Analiz sonucunda VP2 genine ait beklenen moleküler ağırlıkta (~65 kDa) band görüldü. Rekombinant baculovirus ile enfekte Sf9 hücrelerinde protein ekspresyonun tespiti için ise aynı epitoptan yararlanılarak IFA analizi yapılmıştır. Ekspresyonu doğrulanan protein, proteinde bulunan 6×His tag kuyruğundan faydalanılarak Ni-NTA nikel şelatlayıcı resin kiti ile saflaştırıldı. Son olarak füzyon etiketli rekombinant protein AcTEV proteazı ile kesilerek His ve V5 epitoplarından arındırıldı. Bu tez çalışması ile BEVS tekniği kullanılarak doğala en yakın rekombinant proteinin elde edilmesi hedeflenmiştir. Üretilen bu proteinin seroloji temelli hızlı tespit kitlerinin veya aşı niteliği taşıyabilecek rekombinant subunit partiküllerin geliştirilmesine öncü olabileceği düşünülmektedir.