Hematopoetik hücrelerin üretilmesi, çoğaltılması ve farklılaşmasında görevli epo ve tpo'nun medikal biyoteknolojik ürün olarak üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Hematopoetik büyüme faktörleri kan hücrelerinin çoğalmasını ve farklılaşmasını uyaran sitokinlerdir. Eritropoetin (EPO) ve trombopoetin (TPO) başlıca hematopoetik büyüme faktörlerindendir. Eritropoetinin kırmızı kan hücrelerinin oluşumu üzerindeki etkisi iyi bilinmektedir. Trombopoetin megakaryopoezi ve trombosit oluşumunu uyarmaktadır. Hematopoez sırasında, EPO ve TPO sinerjik ve antagonistik bir şekilde etkileşime girebilmektedirler. EPO ve TPO, reseptör bağlama alanlarında önemli bir homoloji sergilemektedirler (% 20 özdeşlik ve % 25 benzerlik). Bu tez çalışmasında, insan EPO proteininin rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak bakteriyel ekspresyon sisteminde üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın üç amacı, biyoinformatik çalışmalar yapılarak E.coli pET30a ekspresyon sistemine klonlanmış halde dizinin temin edilmesi; E.coli BL21 pLysE hücrelerine transformasyonu sonucunda rekombinant olarak ekspresyonu ve saflaştırılması; endotel hücreler için biyolojik karakterizasyonunun belirlenmesidir. Transforme hücrelerin seçimi uygun antibiyotikli besiyerinde gerçekleştirilmiştir. EPO His-etiketi ile eksprese edildi ve Nikel temelli afinite kromotografisi teknikleri saflaştırma amacı ile kullanılmıştır. SDS-PAGE yöntemi ile kalitatif olarak analiz edilmiştir. Bu çalışmada üretilen rekombinant EPO'nun biyolojik olarak aktifliği insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) kullanılarak yapılan poliferasyon analizi ile belirlenmiştir. Bununla birlikte; insan TPO proteininin rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak maya ekspresyon sisteminde üretimi için çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, biyoinformatik çalışmalar sonunda elde edilen pPIC3.5K-TPO vektörü yapay olarak temin edilmiştir. pPIC3.5K-TPO kontsrüktü lineer hale getirilmiştir. Fakat Pichia pastoris GS115 kompetent hücrelerine tranformasyonu ve Pichia pastoris genomuna entegrasyonu sağlanamamıştır.