Functional analysis of HSD3B2 gene mutation

HSD3B3 eksikliği, HSD3B2 genini inaktive edici mutasyondan kaynaklanan konjenital adrenal hiperplazinin nadir bir şeklidir. Dünyada sık görülmese de HSD3B2 eksikliğinin görülme sıklığı Türkiye'de daha yüksektir. Bu hastalık, adrenal bez ve gonadlarda adrenal steroid sentezindeki kusurlar olarak tanımlanır. Bu nedenle mutasyon bölgesinin anlaşılması ve karakterizasyonu çok önemlidir. Ayrıca mutasyonun olası etkisi, mutasyonun HSD3B2 genindeki konumuna bağlı olarak değişebilmektedir. Bu çalışmanın amacı, HSD3B2 enziminin p.L304P mutantı ile in vitro karakterizasyonunu belirlemek ve moleküler yapı ile klinik semptomlar arasındaki ilişkiyi anlamaya çalışmaktır. Ayrıca p.L304P mutasyonunun, HSD3B2 enzimatik aktivitesi ve 17 OH pregnenolon dönüşüm hızı üzerindeki etkisi araştırıldı. Deneyde pCMV3-HSD3B2 vektörü kullanılmış ve alan hedefli mutajenez ile p.L304P mutasyonu oluşturulmuştur. Tüm plazmitler DH5 alfaya transformasyon ile aktarıldı. p.L304P mutasyonunun ve yabani tip HSD3B2 geninin sekansı, sanger dizilimi ile kontrol edildi. Daha sonra yabani tip ve mutant plazmitler HEK293T hücre hattına transfekte edildi. Transfeksiyondan sonra hücreler, DMEM içinde çözünen 17 hidroksipregnenolon ile işleme tabi tutuldu. İşlem farklı zaman aralıklarında ve farklı substrat konsantrasyonlarında yapıldı. Son aşamada DMEM çıkarıldı ve LCMS/MS ile 17 hidroksiprogesteron miktarı ölçüldü. Sonuç olarak, deneysel bulgumuz, mutasyonun dramatik bir şekilde 17 hidroksiprogesteron seviyesinde düşüşe neden olduğunu gösterdi. Ayrıca 17 hidroksipregnenolon miktarının yabani tipte mutant hücre hatlarına kıyasla daha yüksek olduğu tespit edildi.