İnsan spermatogonial kök hücrelerin iki ve üç boyutlu In vitro kültürü

Erkek inferilite sebeplerinden olan azospermi, semen örneğinde hiç sperm görülmemesidir. Spermatogenez erkekte puberte ile başlayıp mitoz ve mayoz bölünme aşamalarından geçerek spermatid oluşumu gerçekleşir. Bu süreci spermatogonium hücreleri mayoz aşamasını kontrol eden faktörler ile ileri farklılaşma göstererek tamamlar. Azospermi olgularında testiküler sperm ektrasiyonu (TESE) ile testisden alınan örneklerde sperm taraması yapılır. Fakat TESE örneklerinde sperm gözlenemeyen olgularda yardımcı üreme teknikleri uygulanamamaktadır. Çalışmada sperm gözlenmeyen fakat spermatogonial hücrelerin olduğu TESE örneklerinden spermatogonial kök hücrelerin farklı kültür ortamlarında farklılaştırılması ve farklılaştırılan hücrelerin karakterizasyonu amaçlanmıştır. Üç boyutlu (3B) kültür ortamlarının in vivo ortamlara benzerlikleri açısından spermatogonium hücrelerinin farklılaşması için in situ organizasyona benzer bir mikroçevre sağlayabileceği öngörüsünden yola çıkılarak, farklı 3D kültür ortamlarının bu farklılaşma sürecine olan etkilerini incelemek hedeflenmiştir. Çalışmanın özgün değeri insan spermatogonium hücrelerinden sperm benzeri hücre farklılaşmasını sağlayacak kültür sistemlerinin karşılaştırılması ve farklılaştırılan hücrelerin karakterizasyonunun hem immunhistokimyasal hem de moleküler düzeyde analiz edilerek bu hücrelerin fonksiyonel olarak spermatogenetik seriye ait hangi hücre aşamasına farklılaştırılabildiğinin analiz edilmesidir. Tez çalışmasında Manisa Celal Bayar Üniversitesi, Aile Planlaması İnfertilite Uygulama ve Araştırma Merkezine başvuran non-obstrüktif azospermi ön tanısı almış, semen örneğinde sperm olmayan ve TESE sonrasında sperm gözlenmeyen 8 hastaya ait örneklerin bir kısmının rutin ışık mikroskobik incelemesi ve DIFF Quick boyaması yapıldı ve spermatogonium hücrelerinin varlığı tespit edildi. Geriye kalan örnekler ise bir gece tripsin/EDTA solüsyonu içerisinde +40oC'de inkübe edildikten sonra jelatinli kültür kaplarında Ham's F10 içerisinde kültüre edildi ve kültür kabına yapışmayan hücreler toplandı. Toplanan hücreler CD90+ MiniMAcs seperasyonu yapıldıktan sonra elde edilen spermatogonium hücreleri, geleneksel 2B, yumuşak agar (SACS) ve kollajen köpük doku iskeleleri içerisinde farklılaştırma kültür vasatı ile 3 hafta boyunca kültüre edildi. RT-PCR gen ekspresyon analizlerinde spermatogonial kök hücrelerden elde edilen komplementer DNA'lar kullanılarak c-kit, Sirtl, Aurora-B, Aurora-C, Jmjdla ve Akrozin gen ekspresyonları belirlendi. GPR125 CD90, c-kit, α6 integrin, β1 integrin ve akrozin dağılımı indirekt immünohistokimya yöntemleri ile analiz edildi. Üç farklı kültür ortamında ileriye farklılaşmanın immunohistokimyasal verileri değerlendirildiğinde, kollajen köpük doku iskeleleri, germ hücrelerin devamlılığı ve çoğalması için uygun olduğu, agarın ise 15inci günden itibaren spermatogenezin farklılaşmasını desteklediği gösterildi. İleriye farklılaşmanın sonuçlarına göre, primer spermatosit veya erken dönem sekonder spermatosit aşamasına kadar olduğu düşünülmektedir. Agar gurubunda GPR125 (15 ve 22 inci günlerde) immunoreaktivitesi zayıf olması Akrozinin şiddetli olması agarın özellikle gerem hücrelerin ileri farklılaşmasını düşündürdü. Özellikle, Akrozin, immunoreaktivitesi agar ve kollajende 15 inci günde şiddetli pozitif iken, 22 inci günde kollajende pozitifliğin devam etmesi kollajenin özellikle germ hücrelerinin çoğalmasını ve ileri farklılaşmasını desteklediğini düşündürmekte ve hipotezi güçlendirmektedir. Matrijel ile kültüre edilen TESE örneklerinden elde edilen spermatogonium hücrelerinde kültürün 2. Haftasında c-kit ekspresyonun azalmış, özellikle Aurora-C ekspresyonun en fazla olarak gözlenmesi kültür ortamının spermatogonium hücrelerinin farklılşamasını desteklediği düşünüldü.