Propolisin antioksidan ve antibakteriyel özelliklerinin incelenmesi ve gıda ürünlerinde potansiyel kullanımı

Propolis, birçok biyolojik aktiviteye sahip reçineli bir arıcılık ürünüdür. Bu tez çalışmasında, Türkiye'nin çeşitli coğrafi bölgelerinden ve arıcılarından toplanmış olan 54 propolis numunesi (32 numune 2013 yılından, 22 numune de 2014 yılından olmak üzere) analiz edilmiştir. Fenolik maddeler %70 etanol kullanılarak ultrasonik banyoda ekstrakte edilmiştir. Toplam fenolik ve toplam flavanoid içerikleri sırasıyla Folin-Ciocalteu ve aluminyum klorür kolorimetrik metodu kullanılarak tespit edilmiştir. Türkiye'nin çeşitli coğrafi bölgelerinden ve arıcılarından toplanmış olan propolis etanolik ekstraktlarının toplam fenolik içerikleri 6.18±0.36 mg GAE/g EEP ve 157.25±12.2 mg GAE/g EEP arasında bulunmaktadır. Aynı örneklerin toplam flavonoid içerikleri de 10.24±0.33 mg QE/g EEP ve 261.61±13.6 mg QE/g EEP olarak bulunmuştur. Bütün örneklerin toplam fenolik ve toplam flavonoid miktarları çok yüksektir. Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden ve arıcılarından 2013 ve 2014 yıllarında toplanmış olan etanolik propolis ekstraktlarının toplam antioksidan kapasiteleri 2,2'-azino-bis(3-etillbenzotiazolin-6-sulfonik asit (ABTS), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), kuprik indirgeyici antioksidan kapasite (CUPRAC) and Demir(III) indirgeyici antioksidan kapasite (FRAP) olmak üzere dört farklı spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. En yüksek antioksidan kapasiteye sahip olan örnek İstanbul şehrinden örnek 23 olarak belirlenmiş ve DPPH, ABTS, CUPRAC ve FRAP metotları kullanılarak antioksidan kapasitesi sırasıyla 1392.27±131.33 µM/g EEP, 1510.64±55.4 µM TE/g EEP, 4220.24±161.75 µM TE/g EEP ve 557.49±20.47 µM TE/g EEP olarak ölçülmüştür. Bunun yanı sıra, bu çalışmada, Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden ve arıcılarından toplanmış olan propolisin etanolik ekstraktlarının başlıca fenolik bileşikleri fotodiyot dizisi dedektör (PDA) bileşenli yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak tanımlanmıştır. Ellidört propolis ekstraktının galanjin, krisin, pinobanksin, pinostrobin, pinosembrin, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit ve t-sinamik asit olmak üzere dokuz farklı fenolik bileşiği tanımlanmış ve miktarları belirtilmiştir. En yüksek krisin miktarı Türkiye'nin İstanbul şehrinden örnek 26 içerisinde bulunduğu (46.79 ± 9.7 mg/g EEP) ve bu örnekteki en yüksek oranda flavonoidin krisin olduğu tespit edilmiştir. Krisin miktarı, 2013 ve 2014 yıllarında Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden toplanmış olan tüm propolis örnekleri içerisinde 1.62±0.37 ve 46.79 ± 9.7 mg/g EPP miktarları aralığında bulunmakta ve bu da Türkiye'den toplanan örnekler arasında krisin içeriği açısından anlamlı farklılıkları açıklamaktadır. Galanjin kavak tipi propolis türünün bir başka önemli flavonoidi olarak İstanbul'da örnek 23'te (31.31 ± 3.92 mg/g EEP) diğer örneklere göre daha yüksek miktarda bulunduğu tespit edilmiştir. Galanjin miktarı, 2013 ve 2014 yıllarında Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden toplanmış olan tüm propolis örnekleri içerisinde 0.37±0.06 ve 31.31 ± 3.92 mg/g EPP miktarları arasında bulunmuştur. Bunun yanında, pinobanksin en yüksek değeri Kocaeli'den örnek 6'da (29.47 ± 0.38 mg/g EEP) bulunmuştur. Türiye'nin Konya şehrinden toplanan propoliste diğer bölgelere kıyasla daha yüksek miktarda pinosembrin bulunmuş (65.94 ± 3.07 mg /g EEP) ve bu örnekteki en yüksek içerikli flavonoid olduğu tespit edilmiştir. Pinostrobin, kavak türü propolislerde yüksek oranda bulunan temel flavonoidlerden bir tanesi olmakla birlikte en yüksek oranda (37.85 ± 0.53 mg/g EEP) İstanbul şehrinde örnek 28'da bulunmuş, fakat bu örnekte pinosembrin (60.3±0.62 mg/g EEP) ve krisinden (41.17±9.9 mg/g EEP) sonra üçüncü en yüksek içerikteki flavonoid bileşeni olduğu tespit edilmiştir. Bütün örnekler arasında en yüksek miktarda (8.84±0.07mg/g EEP) kafeik asit içeren örneğin Kocaeli şehrinden örnek 38 olduğu bulunmuştur. Bunun yanında, en yüksek miktarda ferulik asit de İstanbul şehrinden örnek 26'da (5.19 ± 0.14 mg/g EEP) ölçülmüştür. Propolis örnekleri için tanımlanan diğer bir fenolik asit p-kumarik asittir ve en yüksek değer Düzce-Kocaeli şehrinden örnek 20'de (6.62 ± 0.07 mg/g EEP) tanımlanmıştır. Bununla birlikte, diğer propolis örneklerine kıyasla en yüksek miktarda t-sinamik asit İstanbul şehrinde örnek 23'te (3.64 ± 1.11 mg/g EEP) bulunmuştur. Genel olarak, bireysel fenolik bileşiklerin miktarları Türkiye'nin Marmara Bölgesi'nden toplanan propolis örneklerinde daha yüksek olduğu ve yüksek antioksidan kapasiteleri ile de pozitif yüksek korelasyonu olduğu tespit edilmiştir. 2013 ve 2014 yıllarında toplanmış olan propolis örnekleri (54 örnek) 4 örnek Ege Bölgesi, 5 örnek Karadeniz Bölgesi, 4 örnek İç Anadolu Bölgesi, 6 örnek Doğu Anadolu Bölgesi, 29 örnek Marmara Bölgesi ve 6 örnek de Akdeniz Bölgesi olmak üzere 6 farklı coğrafi bölgeden alınmıştır. Genel Lineer Model prosedürü Tek Değişken Analizi'ne göre, farklı bölgelerden toplanmış olan propolis örneklerinin toplam fenolik içerikleri ve toplam flavonoid içerikleri arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmakta (p < 0.05), fakat 2013 ve 2014 yılları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmamaktadır (p > 0.05). Buna rağmen, farklı bölgeler ve farklı yıllar faktör olarak kabul edildiğinde propolis örneklerinin antioksidan kapasiteleri arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildir (p > 0.05). Propolis örneklerinin fenolik bileşenleri arasında da 2013 ve 2014 yılları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmamaktadır (p > 0.05). Buna rağmen, bölgeler faktör olarak dikkate alındığında, propolis örneklerinin fenolik bileşenleri olan krisin, galanjin, p-kumarik asit, pinobanksin, pinosembrin, t-sinamik asit bölgeler arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermekte, ama diğer fenolik bileşikler olan kafeik asit, ferulik asit ve pinostrobin istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermemektedir. Bunun yanında, 6 farklı coğrafi bölgeden toplanmış olan propolis örneklerinin toplam fenolik ve flavonoid miktarları, fenolik profilleri ve antioksidan kapasiteleri (4 farklı metotla) arasındaki farklılıklar Temel Bileşen Analizi (TBA) ile analiz edilmiştir. İlk 3 temel bileşen (TB), sırasıyla TB1 %65.5, TB2 %9.6 ve TB3 %7.7 olmak üzere toplam varyansın %82.8'ini açıklamaktadır. Ayrıca, Diskriminant Analizi (DA) propolis örneklerinin toplanmış olduğu coğrafi bölgelerin sınıflandırılması için kullanılmıştır. Sonuç olarak, dokuz fenolik bileşiğin 6 tanesi propolis örneklerinin coğrafi bölgelere göre ayrılması için istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.05) sonuç vermiştir. Bu fenolik bileşikler, propolisin coğrafi bölgelere göre ayırt edilmesinde güvenilir sonuçlar verip vermediğinin test edilmesi için Lineer Diskriminant Analizine (LDA) tabi tutulmuşlardır. Sonuçlar, pinosembrin, t-cinnamik asit, p-kumarın asidi ve krisin ile tüm belirleyiciler için coğrafi bölgeler arasında anlamlı farklılıkların bulunduğuna dair güçlü istatistiksel kanıtın olduğunu göstermektedir. Ayrıca, sınıflandırmayı birbirine bağlı kovaryans matrisleri üzerinde değil de ayrı kovaryans matrisleri üzerine dayandırmak için kullanılan Karesel Diskriminant Analizi, eşit olmayan grup varyansları varsayarak kullanılmıştır. İlk diskriminant fonksiyonu (F1) toplam varyansın %71.50'ini oluştururken, ikinci ve üçüncü diskriminant fonksiyonları %14.31 ve % 8.29'unu oluşturmakta olduğu tespit edilmiştir. Propolis ekstraktlarının anti-proliferatif ve proliferatif etkileri 2 farklı meme kanser hücre hattı olan MDA-MB-231 ve UACC-3199 üzerinde ve 2 normal hücre hattı olan fibroblastlar ve fare mezankimal kök hücre hattı üzerinde incelenmiştir. Bu çalışmada Türkiye'nin farklı coğrafi bölgelerindeki 54 farklı arıcısından 2013 ve 2014 yıllarında toplanmış olan propolis numuneleri kullanılmıştır. Bütün propolis numuneleri karıştırılarak toz haline getirilmiştir. Propolis etanolik ekstraktı %30 propolis tentürü kullanılarak ve dönen buharlaştırıcı kullanılarak etanol buharlaştırılarak hazırlanmıştır. XTT sonuçlarına göre, Türk propolis numunesi MDA-MB-231 ve UACC meme kanser hücre hattı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı anti-proliferatif etki göstermiştir. İlginç olarak, Türk propolis örneğinin hem fibroblastlar hem de fare mezenkimal kök hücreler üzerinde proliferatif etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar, Türk propolisinin meme kanseri tedavisinde ileri tetkikler için güçlü bir ajan olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bu tez çalışmasında ayrıca ısıl işlem görmüş sucuk örnekleri 9 farklı formülasyonda pilot ölçekli olarak üretilmiştir. Isıl işlem görmüş sucuk formülasyonları : (R) 150 ppm sodyum nitrit içeren referans örnek; (A) 150 ppm sodyum nitrit ve 0.25% propolis ekstraktı içeren örnek; (B) 150 ppm sodyum nitrit ve 0.50% propolis ekstraktı içeren örnek; (C) 50 ppm sodyum nitrit ve 0.25% propolis ekstraktı içeren örnek; (D) 50 ppm sodyum nitrit ve 0.50% propolis ekstraktı içeren örnek; (E) 75 ppm sodyum nitrit ve 0.25% propolis ekstraktı içeren örnek; (F) 75 ppm sodyum nitrit ve 0.50% propolis ekstraktı içeren örnek; (G) 100 ppm sodyum nitrit ve 0.25% propolis ekstraktı içeren örnek; (H) 100 ppm sodyum nitrit ve 0.50% propolis ekstraktı içeren örnek olarak üretilmiştir. Isıl işlem görmüş dokuz farklı formülasyonda sucukların üretimlerinden itibaren 200. depolama gününe kadar fizikokimyasal analizleri (pH, nem içeriği, yağ içeriği, tuz içeriği, nem/protein içeriği, kollajen içeriği, renk, tiobarbitürik asit reaktif maddeler) ve mikrobiyolojik analizleri (toplam aerobik bakteri, Eschericia coli, toplam koliform bakteri, toplam maya ve küf, Lactobacillus spp., Salmonella spp., Listeria monocytogenes) yapılmıştır. Bunun yanında, ısıl işlem görmüş sucuklarda propolis ekstraktı içeren sucukların propolis ekstraktı içermeyen referans örneği ile arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılığın var olup olmadığı anlaşılması için duyusal analiz gerçekleştirilmiştir. Depolama süresi boyunca yapılan analizlerin sonucunda bütün örneklerin fizokokimyasal analiz sonuçlarının Türk Gıda Kodeksi'ne uygun değerler içerisinde bulunduğu görülmüştür. TBARS değerlerinin, propolis ekstraktı ilavesine bağlı olarak istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde etkilendiği tespit edilmiştir. Ayrıca, propolis ekstraktı konsantrasyonunun %0.25'den %0.50'ye arttırılması da sucuk örneklerinin TBARS değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı azalmaya (p < 0.05) neden olmaktadır. Kontrol örneği maksimum TBARS değeri olan 1.08±0.012 mg/kg ürün değerine 200. depolama gününde yapılan analiz sonucunda ulaşmış ve istenmeyen koku oluşumunun 1 mg/kg ürün değeri üzerinde oluştuğu saptanmıştır. Propolis ekstraktı içeren ısıl işlem görmüş sucuk ürünlerinin kontrol örneği ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı daha düşük sonuçlara (p < 0.05) sahip olduğu görülmektedir. Sonuç olarak yüksek antioksidan kapasitesine bağlı olarak propolis ekstraktının sodyum nitrite göre daha etkili olduğu (p < 0.05) tespit edilmiştir. Toplam aerobik bakteri, E. coli, toplam koliform bakteri, toplam maya ve küf, Lactobacillus spp., Salmonella spp., L. monocytogenes mikrobiyolojik analizlerine göre bütün örneklerin depolama süresi boyunca gıda güvenliği kuralları açısından kabul edilebilir olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle, propolisin güçlü bir antibakteriyel ajan olduğu ve 200 gün depolama süresince gıda güvenliğini sağlamak için, ısıl işlem görmüş sucuk formülasyonlarında kullanıldığında çok az miktarlarda dahi etkili olabileceği sonucu çıkartılmıştır. Bunun yanında, nitrit ve propolisin bağımsız iki faktör olarak kabul edildiği seçilmiş değişkenlere UNIVARIATE analizinin Genel Lineer Modeli (GLM) uygulanmıştır. Bu analiz, bu parametrelerin ve çeşitli fizyokimyasal ve mikrobiyolojik analizler üzerindeki etkileşimlerinin çeşitli düzeylerde etkilerini açıklamayı amaçlamaktadır. Propolis ilavesinin ısıl işlem görmüş fermente sucukların nem, yağ, kollajen miktarları, TBARS değeri, renk (b* değeri) gibi fizikokimyasal özellikleri üzerine ve toplam küf sayısı mikrobiyolojik özelliği üzerine istatistiksel olarak önemli (p < 0.05) farklılıklar yarattığı bulunmuştur. Nitrit konsantrasyonun ise, ısıl işlem görmüş fermente sucukların yağ, protein, kollajen içeriği, TBARS değeri, renk (a* ve b* değerleri) gibi fizikokimyasal özellikleri ile toplam küf sayısı mikrobiyolojik özelliği üzerinde istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.05) etkisi olduğu bulunmuştur. Bunun yanında % propolis ve nitrit konsantrasyonu etkileşimlerinin etkisinin ısıl işlem görmüş sucukların pH, nem, yağ, kollajen içeriği, TBARS değerleri ve renk özellikleri olan fizikokimyasal özellikleri üzerinde istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.05) sonuçlar verdiği tespit edilmiştir. Bunun yanında, propolis ekstraktı içeren ısıl işlem görmüş sucuk örneklerinin kontrol örneğinden genel anlamda duyusal farklılıklarının tespit edilmesi amacıyla ikili-üçlü test metodu kullanılarak duyusal analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonucunda, A, E ve F örneklerinin anlamlılık düzeyinin altında olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, ısıl işlem görmüş sucuk ürünlerinde propolis ekstraktı içermeyen ama 150 ppm sodyum nitrit içeren referans örneğinin yerine 75 ppm sodyum nitrit ve güçlü antimikrobiyal ajan olan propolisin (0.25% veya 0.50% konsantrasyonlarda) kullanımının duyusal açıdan istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.05) bir farklılığa neden olmadığı bulunmuştur. Isıl işlem görmüş sucuk üretiminde sodyum nitrit oranının azaltılarak güçlü antimikrobiyal etkiye sahip propolis ekstraktının kullanılması sağlıklı bir alternatif olacaktır.