Transgenik farelerde deneysel alerjik ensefalomiyelitis modeli kullanılarak multipl skleroz hastalığında perisitlerin rolünün incelenmesi

Giriş: Perisitler, endotel hücrelerinin abluminal tarafında yer alan mural hücrelerdir. Bu hücreler kan-beyin bariyeri (KBB) oluşumunda ve santral sinir sistemi (SSS) bağışıklık homeostazını sağlamada önemli rollere sahiptirler. Son yıllarda, perisit hücre kültürleriyle ve iyi karakterize edilmiş perisit ablete fare modelleyle yapılan çalışmalar, perisitlerin ayrıca immünomodülatör fonksiyonlara sahip olduğunu göstermektedir. Fakat, bu çalışmalarda kullanılan hayvanlar doğuştan perisit eksikliği olan fare modelleridir ve zaten yetersiz bir BBB oluşumuna ve bozulmuş bir mikrovaskülatür morfolojiye sahiptirler. Ayrıca, gelişmekte olan farelerde perisitlerin kısmi ablasyonu, hem normal fizyolojik durumda hem de patolojik koşullarda lökositlerin SSS'e infiltrasyonunun artmasına neden olduğu bilinmektedir. Bu anormallikler, nöroinflamatuar hastalıklarda perisit fonksiyonuyla ilgili gerçek bulguları gölgeyleyebilir. Bu nedenle, mevcut perisit eksikliği modellerini kullanarak perisitlerin nöroinflamatuar rollerini incelemek, bulgular hakkında güvenli sonuçlar çıkarma konusunda yetersiz kalmaktadır. En yaygın nöroinflamatuar CNS hastalığı Multipl Skleroz'dur (MS). MS hastalığı periferik inflamatuar hücrelerin KBB'nin açılmasından sonra beyne sızdığı ve miyelin kılıflarının, oligodendrositlerin ve altta yatan sinir liflerinin dejenerasyonuna neden olduğu bir otoimmünite hastalığıdır. Başlangıçta bu bağışıklık hücrelerinin CNS parankimine olağandışı geçişine neden olan hücreler henüz net olarak tanımlanmamıştır. Bunun yanı sıra, hastalığın patogenezi sırasında meydana gelen olaylar dizisi de bilinmemektedir. Amaç: Bu çalışmada, ilk olarak, normal gelişmiş vasküler yapıya ve sağlıklı KBB'ye sahip yetişkin farelerde tamoksifen ile indüklenebilir bir perisit ablasyon modeli oluşturmayı ve karakterize etmeyi amaçladık. İkinci olarak, en sık kullanılan MS benzeri nöroinflamasyon modeli olan deneysel alerjik ensefalomiyelit (DAE) modeli aracılığıyla perisit yokluğunun MS patogenezine etkilerini araştırdık. Yöntem: Indüklenebilir perisit ablasyon modelimizi oluşturmak için PDGFRβ-PA2-CreER+/- fareler (JAX Laboratories, 030201) ile Rosa26-DTA176+/+ fareler (JAX Laboratories, 010527) çaprazlandı. Bu çiftleşme sonucu elde edilen 9-10 haftalık yavrular genotiplendikten sonra, Pdgfrβ-positive perisitlerinde difteri toksin ifadesini indüklemek için iki (2X), üç (3X) veya beş (5X) ardışık gün boyunca intraperitonel yolla 100 mg/kg tamoksifen enjeksiyonları yapıldı. PDGFRβ-Cre+/DTA176+ (Cre-pozitif) fareler perisit ablasyon grubu olarak ve PDGFRβ-Cre-/DTA176+ (Cre-negatif) fareler kontrol olarak karakterize edildi. Modelimizi karakterize etmek için, her iki grubun beyin ve omurilik dokularında endotel üzerindeki perisit kaplama alanı, PDGFRβ gen ifade seviyesi ve damar ilişkili değişiklikler incelendi. İncelemeler için sırasıyla immünohistokimya, kantitatif PCR ve AngioTool 1 yazılımı kullanıldı. Analizler kısa dönem (15 gün) ve uzun dönem (60 gün) için ayrı ayrı yapıldı. Ek olarak, uzamsal tanıma belleği (Y-labirent performansı) ve lokomotor aktivite (Kavrama Kuvveti Testi) davranış testleri yapıldı. Karakterizasyon deneylerinin sonuçlarına göre, sonraki DAE deneyleri için iki ardışık gün TAM enjeksiyonu (2X TAM) ile indüklenen perisit ablasyon grubu seçildi. DAE modeli, TAM enjeksiyonlarından 15 gün sonra MOG35-55 DAE kiti (Hooke Labs, EK2110) ile başlatıldı. DAE deneylerinde perisit ablasyonu kontrolü olarak kontrolleri olarak Cre-negatif ve yabanıl tip C57BL/6 fareleri kullanıldı ve sonuçlar tartışılırken iki grup birlikte "yabanıl tip fareler" olarak değerlendirildi. DAE deneyleri başlatıldıktan sonra, ağırlık ve klinik semptom varyasyonları 28 gün boyunca izlendi. İstatistiksel analiz, 2-yönlü ANOVA tekrarlanan ölçümler çoklu karşılaştırma testi ile yapıldı. Bulgular: Perisit endotel kaplama alanında cortekste %75 (+-SEM=0.9192) (p<0.01) ve omurilikte %40 (+-SEM=2.385) azalma (p<0.01) gözlemlendi. 2X TAM perisit ablasyon grubu fareler (n=8), Cre-negatif kontroller (n=7) ile karşılaştırıldığında, perisit kaplama alanı sonuçlarına benzer şekilde, Pdgfrβ gen ekspresyonu kortekste %55'e (+-SEM=2.230) (p=0.036) ve omurilikte %60'a (+-SEM=4.511) düştü (p=0.036). Damar analizleri ve davranış analizleri ise, 2X TAM perisit ablasyonlu grup ile Cre-negatif kontroller arasında önemli bir fark olmadığını ortaya koydu. Bu sonuçlardan yola çıkarak DAE deneylerinde 2X TAM ile oluşturulan perisit ablete farelerin kullanılması kararlaştırıldı. DAE sırasında, perisit ablasyonlu fareler (n=7) ve yabanıl tip fareler (n=23), DAE modelinin 15. gününe kadar skor 1.5 seviyesine benzer klinik gelişime sahipti. Fakat, deneyin bu noktasından sonra, perisit ablasyonu yapılmış farelerin semptomlarının daha yüksek bir alevlenme oranı ile kötüleştiği izlendi. Bu fark 20. günden sonra istatistiksel olarak anlamlılık kazandı ve bu anlamlılık deneyin sonuna kadar devam etti (20-28. günlerde p= 0.0141, 0.0056, 0.008, 0.0276 ve 0.0188). Eşzamanlı olarak, DAE'nin ilk semptomlarından başlayarak, perisit ablasyonu yapılmış fareler yabanıl tip farelerden daha fazla kilo kaybettiler (p= 0.0411, 0.0067, 0.0236, 0.0093, 0.01, 0.0194 ve 0.0081, 8. gün ve 16-28. günlerde). Öte yandan omurilik dokularının immünohistokimyasal analizi, yabanıl tip farelerin lezyonlarına kıyasla perisit ablasyonlu farelerde enflamatuar lezyonların sayısının ve boyutunun daha fazla ve daha büyük olduğunu ortaya koydu. Ek olarak, beynin periventriküler bölgesi, perisit ablasyonlu farelerde benzeri görülmemiş enflamatuar odaklar sunarken, yabanıl tip DAE'li fare beyinlerinde herhangi bir hücre birikimi gözlenmedi. Sonuç ve Yorum: Bu projede, yetişkin farelerde TAM ile indüklenebilir bir perisit ablasyon modeli oluşturuldu ve karakterize edildi. Bu yeni nesil perisit ablasyon modelinin diğer modellere kıyasla avantajı, bu modelde perisit ablasyonunun hem de ablasyon miktarının hem de ablasyonun başlangıç zamanının kontrol edilebilmesi ve bu kontrol süreçlerinde modelin herhangi bir toksin enjeksiyonu gerektirmemesidir. Bu proje kapsamında, perisit ablasyon modelimizin DAE modelinde kullanılmasıyla, perisitlerin nöroinflamasyonun çözülmesi sırasında koruyucu bir rol oynadığı gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: KBan-Beyin Bariyeri, Perisit, Perisit Ablasyonu, Pdgfrβ, Multiple Sclerosis, Deneysel Allergic Ensefalomiyelit, Transjenik Fare Modelleri