Yeni, nikotinamid adenin dinükleotid bağımlı format dehidrojenaz enzimlerinin araştırılması

NADPH bağımlı oksidoredüktazlar, kiral bileşiklerin endüstriyel üretimi için değerli biyokatalizörlerdir. İhtiyaç duydukları yüksek maliyetli kofaktörlerin, yerinde rejenerasyonu için Format dehidrojenaz enzimleri (FDH) oldukça değerli bir seçenektir. NADP+ bağımlılığı ve çok yönlü kararlılık gibi özelliklere sahip olabilecek FDH enzimlerinin tespit edilmesi, koenzim rejenerasyonu açısından bir gerekliliktir. Bu çalışmada iki ayrı NADP+ bağımlı FDH enziminin rekombinant DNA teknikleri ve protein mühendisliği metodları kullanılarak doğal kaynaklardan, biri patojenik bakteri olan Burkholderia dolosa PC543 (BdFDH) ve diğeri etanole toleransı olan bir bakteri olan Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 (LbFDH), elde edilmesi ve ayrıca amino / karboksil uçlarına ekli histidin uzantısının BdFDH enzimi üzerine olan etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu mikroorganizmalardan iki yeni NADP+ bağımlı FDH enzimi klonlanmış, saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. İlk FDH, B. dolosa PC543 bakterisinden elde edilmiş, çift koenzim spesifitesi olan ve asidik pH değerlerinde çalışabilen, DMSO toleransına sahip yeni bir enzimdir. Amino / karboksil ucunda histidin uzantısı olan BdFDH' ler, ayrı ayrı ifade edilmiş ve karboksil ucunda histidin etiketi olan enzimin çözünür halde ve aktif iken amino ucunda histidin uzantısı olan FDH enziminin inklüzyon cisimciği şeklinde olduğu ve aktivitesinin olmadığı tespit edilmiştir. Diğer putatif NADP+ bağımlı format dehidrojenaz geni L. buchneri NRRL B-30929 bakterisinin genomik DNA' sından klonlanmış ve elde edilen LbFDH enzimin asidik koşullarda (pH 4.8-6.2) oldukça aktif olduğu ve yüksek sıcaklık değerlerinde optimum aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Enzimin, eşdeğerleri arasında sıradışı bir Tm değerine (78 ◦C) sahip olduğu diferansiyel taramalı kalorimetri ile belirlenmiştir. Dahası, LbFDH' ın 60 ◦C'de ve NADP+ varlığında elde edilen spesifik aktivitesi (24.6 U/mg) tüm NADP+ bağımlı FDH'ler arasında sıradışı bir özelliktir. Enzimler kinetik sabitleri yönüyle değerlendirildiğinde BdFDH enziminin özellikle format iyonu ile LbFDH enziminin ise kofaktör ile etkileşimi oldukça dikkat çekicidir ve protein mühendisliği çalışmaları için model olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Sonuç olarak, DMSO toleransı, asidik koşullara olan dayanıklılık ve koenzim tercihi nedeniyle bu iki yeni enzim, kiral ara bileşiklerin biyokatalizinde kofaktör geri dönüşümünde kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir.