Kolon kanseri dokularında yerleştiği bilinen bacteroıdes fragılıs in d-laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bacteroides fragilis çalışmaları uzun süredir devam etmektedir ve yakın geçmişte yapılan çalışmalar Bacteroides fragilis?in dünya genelindeki en yaygın üçüncü kanser türü olan kolorektal kanseri ile ilişkisini göstermektedir. Bacteroides fragilis insanlara yararlı olan nantoksijenik ve hastalık yapan enterotoksijenik olmak üzere iki farklı soy altında sınıflandırılmaktadır. Dünya genelindeki Bacteroides fragilis infeksiyonlarına karşı antibiyotik direncinin olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle, bakteri infeksiyonlarıyla savaşmak için yeni yaklaşımlar bulunmasına yönelik çalışmaların yapılması zorunludur. Bu tez çalışmasında, enterotoksijenik Bacteroides fragilis metabolizmasının, bakteri anaerobik metabolizmaya sahip olduğu için, D-laktat dehidrogenaz enziminin hedeflenmesiyle durdurulması amaçlanmıştır. L-laktat dehidrogenaz Bacteroides fragilis genomunun tamamında araştırılmıştır. Bakteri genomunda L-laktat dehidrogenaz varlığının bildirilmesine rağmen, bu çalışmadaki bulgular Bacteroides fragilis?te L-laktat dehidrogenaz enziminin olmadığını göstermektedir. Bu çalışmaya kadar enterotoksijenik Bacteroides fragilis?e ait D-laktat dehidrogenaz enziminin gen dizisi belirlenmemiştir. Literatürde ilk kez D-laktat dehidrogenaz klonlanmış ve aktif protein halinde ifadesi yapılmıştır. Nantoksijenik Bacteroides fragilis?in D-laktat dehidrogenaz enzimi de pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır ve klonlanan her iki gen başlama ve sonlanma kodonu dahil 1011 baz çiftinden oluşmaktadır. Her iki gen farklarına göre kıyaslanmıştır; nükleotid düzeyinde on bir farkın ve amino asit düzeyinde üç farkın olduğu bulunmuştur. Bacteroides fragilis D-laktat dehidrogenaz enzimi C-terminalinde 6 Histidin aminoasidi bulunan pLATE31 vektörüne klonlanmıştır ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde 37.6 kDa?luk bir protein olarak ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Hücrelerin 0.1 mM IPTG ile indüklendiği ve 25°C?de 5 saat geliştirildiği koşullar en iyi ekspresyon koşulları olarak belirlenmiştir. Enzimi saflaştırmak için Ni-NTA agaroz kolonlar kullanılarak affinite kromatografisi yöntemi uygulanmıştır. Proteinin SDS-PAGE ile analizi 19.8 mg/litre ile yüksek miktarda ve %95?in üzerinde saflıkta elde edildiğini göstermiştir. Kinetik karakterizasyon pH: 7.5, 25°C?de gerçekleştirilmiştir. Grafit 3.0 programı saflaştırılan enzimin staedy state kinetik parametrelerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Piruvat substrat olarak kullanıldığında sırasıyla Vmax 0.1594, Km 0.3752 mM, kcat 32.4 s¯¹,kcat/km 86.35 mM¯¹s¯¹, değerleri bulunmuştur. Bu parametreler çalışılan enzim için ilk kez belirlenmiştir. Bacteroides fragilis D-laktat dehidrogenaz enziminin homoloji modellemesi aynı enzimin kristal yapısı bilinen Lactobacillus helveticus türü kalıp alınarak gerçekleştirilmiştir. Oluşturulan model ile ayrıca moleküler yerleştirme çalışmaları yapılmıştır. Bacteroides fragilis enfeksiyonlarını tedavide kullanılan bir antibiyotik olan Mezlocillin, NADH halkasına en uygun bileşik olarak belirlenmiştir. Bütün bu bulgular ileride yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarına uygun olarak, kolon kanseri ile ilişkili olduğu bilinen Bacteroides fragilis enfeksiyonları ile savaşmak için enzim inhibitörlerinin geliştirilmesinin önünü açacaktır.