Doğal bakteri suşlarından tirozinaz enzim izolasyonu, karakterizasyonu, üretici genin klonlanması, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve l-dopa ve melanin üretimi gibi biyoteknolojide kullanılabilirliği

Tirozinaz, L-tirosin'in L-DOPA'ya ve son olarak melanin'e dönüşümünü katalize eden tip-3 bakır içerikli bir enzimdir. Melanin, biyoteknolojik ve biyolojik fonksiyonları ile geniş bir yelpazeye sahiptir ve ilaçbilim, kozmetik ve başka endüstri alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. L-DOPA, Parkinson hastalıkları tedavisinde tercih edilen bir ilaçtır. Bu çalışmada, tirozinaz enzimi bulunduran bir Bacillus türü doğadan izole edilmiştir ve bu suş morfolojik, biyokimyasal ve moleküler analiz ile tanımlanmıştır. Doğal izolattan enzimin üretimi klasik ve istatistiki metotlar (Box-Behnken dizaynı) ile optimize edilmiş ve enzim karakterize edilmiştir. dahasonra, tirozinaz kodlayan gen ekspresyon vektörü olarak pET22b kullanılarak iki ekspresyon sisteminde (E.coli BL21 (DE3) pLysS and Rosetta-gami 2 (DE3) pLysS) klonlanmıştır. İki sistemindeki gen ekspresyonları karşılaştırılmıştır. Gen fragmenti, Sanger sekanslama metoduyla selamlanmıştır. Sekans, farklı biyoinformatik programları ve web siteleri kullanarak insiliko analize tabi tutulmuştur. L-tirozin'in L-DOPA ve melanine dönüşmesi TLC ve HPLC yöntemleri ile saptanmıştır. Üretilen melanin incelenmiştir. İzole edilen suş Bacillus megaterium ile %99 homoloji göstermiştir. Doğal M36 Bacillus türünden enzimin üretimi 0.05 IU/ml olarak belirlenmiştir. Kültür koşullarının optimizasyonundan sonra 0.38 IU/ml'ye ulaşmıştır. Rekombinant M36 tirozinaz enziminin ekspresyonunun optimizasyonundan sonra ise 31 IU/ml'ye ulaşmıştır. Doğal ve rekombinant M36 tirozinaz enzimi için optimum sıcaklık sırasıyla 40 °C ve 45-50 °C; optimum pH sırasıyla 7.0 ve 7.5 idi. SDS-PAGE analizinde, doğal ve rekombinant M36 tirozinaz enzimi sırasıyla 34kDa ve 35 kDa olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada üretilen M36 melanin, FT-IR ve EPR analizine göre Sigma standart sentetik melanin ile yapısal benzerlik göstermiştir. Aynı zamanda, üretilen M36 melanin önemli anti-bakteriyel, anti-UV ve anti-oksidan etki göstermiştir. MTT deneyi, M36 melaninin anti-kanser etkisi olduğunu göstermiştir.