Kanatlı hayvanlarda yaygın olarak görülen viral ve bakteriyel patojenlerin multipleks PCR tabanlı hızlı tanısı için kit geliştirilmesi

Kanatlı hayvan hastalıklarının hızlı teşhisi, tedavi, kontrol ve biyogüvenlik açısından önemlidir. Bu tez çalışmasında, birden fazla patojeni aynı anda tespit edebilen Multipleks PCR temelli tanı kitinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. İnfeksiyöz Laringotracheit hastalığı (ILT - GaHV-1), Newcastle Hastalığı Virüsü (NDV), Avian İnfluenza Virüsü alt tipleri (AIV'ler – A/H5N1, A/H9N2, A/H7N9), E.coli. ve E.coli O157:H7, Salmonella spp. ve Pasteurella multocida ilgili patojenler olarak belirlenerek herbirine özgün primer-problar tasarlandı. Patojenlerin tüm genom dizileri veri bankalarından elde edildi ve genler seçilerek bu genlere ait diziler üzerinden patojen-spesifik primerler tasarlandı. Primer-prob tasarımı için Eurofinsgenomics'e ait in-siliko aracı kullanıldı. Elde edilen (GC oranı, Tm derecesi, hedeflenen amplikon uzunluğu) veriler BLAST ve Primer3 in-siliko yazılım araçları ile doğrulandı. Tasarlanan primer-prob dizilerinin başka bir virüs /bakteri genomu ile eşleşmediğini ve patojen-spesifik olduğu NCBI üzerinden bilinen tüm virüs/bakteri genomları ile karşılaştırılarak yapıldı. Primer-prob karakterizasyonları, optimizasyonları ve minimum tespit edilebilirlik (LOD) değerleri saptanarak testlerde kullanıldı. Aynı anda farklı patojenlere ait prob ışımalarının ölçülebilmesi için farklı florofor kanallar kullanıldı ve patojen-spesifik sigmoidal eğriler saptandı. Prob dizaynında, 5' ucunda florofor ve 3' ucunda söndürücü (quencher) olmak üzere farklı boyalar kullanılmıştır. Buna göre; ILT için Texas Red – BHQ1, AIV A/H5N1 için FAM – MGB, AIV A/H9N2 için HEX – MGB, AIV A/H7N9 için Texas Red – BHQ1, NDV için Cy-2 – BHQ2, E. coli ve E. coli O157:H7 için FAM – MGB, Salmonella spp. için HEX – MGB, P. multocida için Cy5 – BHQ2 kombinasyonları tercih edilmiştir. Buna karşılık, floresan sinyallerin izlendiği dedeksiyon kanalları şu şekilde belirlenmiştir: ILT için ROX kanalı, AIV alt tiplerinden A/H5N1 için FAM kanalı, A/H7N9 için ROX kanalı, A/H9N2 için HEX kanalı, NDV için Cy5 kanalı, E. coli ve E. coli O157:H7 için FAM kanalı, Salmonella spp. için HEX kanalı, P. multocida için ise Cy5 kanalı kullanılmıştır. Bulgular; patojen-spesifik primerler ile tüm etkenlerin saptanabildiğini gösterdi. Test ortamında aynı anda birden fazla etkenin genomu varlığında da tüm pozitif örneklerin başarıyla saptanabildiği ortaya konuldu. Kullanılan master mix ve primer-prob miktarları optimize edilerek birim test sarfiyatları azaltıldı ve minimize edilerek birim test maliyetleri yaklaşık %25 oranında düşürüldü. Çalışmalarda nükleik asit konsantrasyonu LOD miktarları değerlendirildi ve bu değerin P.multocida için 0,5 ng ve diğer tüm patojenler için 0,05 ng olduğu belirlendi. Sonuç olarak; ILT, NDV, AİV'ler (A/H5N1, A/H9N2, A/H7N9), E.coli, E.coli O157:H7, Salmonella spp. ve P. multocida nükleik asitlerinin aynı anda ve tek bir tanı kitiyle saptanabildiği ve ilgili patojenlerin neden oldukları hastalıkların aynı anda ve tek bir kit ile teşhis edilebilmesine olanak sağlayan bir Real-Time PCR tabanlı multiplex hızlı tanı paneli kiti geliştirildi. Anahtar Kelimeler: Kanatlı hayvanlar, RT-PCR, tanı kiti