Katekolün parental ve epurubicin dirençli akciğer kanseri hücrelerinde apoptozisi hangi sinyal yolu ile uyardığının araştırılması

Bu çalışmada bir benzen türevi olan katekolün parental akciğer kanseri (P H1299), epirubicin-HCl dirençli akciğer kanseri (R-H1299) ve sağlıklı fibroblast (Bj) hücreleri üzerine olan sitotoksik, antiproliferatif, hücre döngüsü bloke edici ve apoptotik etki mekanizmaları araştırılmıştır. Her bir hücrede, apoptotik sinyal yolunun en fazla hangi mekanizma ile uyarıldığı ortaya konulmuştur. Katekolün hücreler üzerine sitotoksik etkisi Cell Titer-Blue® Cell viability assay kiti ile belirlenmiştir. Katekolün P-H1299, R-H1299 ve Bj hücrelerindeki IC50 değeri (hücrelerin %50 sini öldüren konsantrasyon) sırasıyla 58 µg/ml, 90 µg/ml ve 207 µg/ml olarak hesaplanmıştır. Katekolün P-H1299 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi hem R-H1299 hem de Bj hücrelerinden daha yüksek bulunmuştur. Çalışmamızda kaspaz 3/7 aktivitesi ve mRNA ekspresyonları katekolün IC50 konsantrasyonu ile 24 saat muamele edilen hücrelerde çalışıldı. Hücrelerde apoptotik yolağın anahtar enzimlerinden biri olan kaspaz-3/7 aktivitesi ApoTox-Glo Triplex Assay (Promega) kiti kullanılarak ölçüldü. Hücrelerdeki kaspaz 3/7 aktivitesi kontrol hücrelerle karşılaştırıldığında P-H1299 hücrelerinde 2,8 kat, R-H1299 hücrelerinde 2,3 kat ve Bj hücrelerinde 1,6 kat fazla bulundu. P-H1299 hücrelerinin kaspaz 3/7 aktivitesi, R-H1299 hücrelerinden 1,2 kat, Bj hücrelerinden 1,75 kat daha yüksek bulundu. Katekolün hücrelerde apoptozisi hangi sinyal yolu ile uyardığını araştırmak için RT-PCR (ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu) ile Bax (Bcl-2 Associated X Protein), Bcl-2 (B-Hücre Lösemi 2), ATM (Ataxia telangiectasia mutated kinase), ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3-related), siklin D1, PCNA (prolifere hücre nükleer antijeni) genlerinin mRNA ekspresyonları araştırılmıştır. Katekol uygulanan tüm hücreler karşılaştırıldığında, antiproliferatif etkiyi ortaya koyan PCNA ve hücre döngüsü belirteci olan siklin D1 mRNA ekspresyonları en düşük P-H1299 hücrelerinde bulunmuştur. Katekolün hücrelerdeki apoptotik sinyal yolunu uyarma mekanizmalarından biri de pro-apoptotik bir gen olan Bax'ın mRNA ekspresyonunun antiapoptotik bir gen olan Bcl-2'nin mRNA ekspresyonuna oranının ölçülmesidir. Katekole 24 saat maruz kalan P-H1299, R-H1299 ve Bj hücrelerinde Bax/Bcl-2 oranları sırasıyla 1,5 kat, 2,0 kat ve 0,8 kat olarak hesaplanmıştır. Bax/Bcl-2 sinyal yolu en fazla R-H1299 hücrelerinde uyarılmıştır. Katekol P-H1299 ve R-H1299 hücrelerinde Bax/Bcl-2 oranının artmasına neden olarak apoptotik etki göstermiştir. Ancak Bj hücrelerinde Bax/Bcl-2 oranının azalmasına neden olarak antiapoptotik bir etki göstermiştir. Katekolün hücrelerde meydana getirdiği DNA hasarını ortaya koymak için ATM ve ATR genlerinin mRNA ekspresyon düzeyleri ölçülmüştür. Katekol ile muamele edilen P-H1299, R-H1299 ve Bj hücrelerinde hem ATM hem de ATR mRNA ekspresyonu kontrole göre artmıştır bu artış katekolün hücreler üzerinde DNA hasarına neden olduğunu göstermektedir. Sağlıklı hücrelerle kıyaslandığında R-H1299 hücrelerinde ATM ve ATR mRNA ekspresyonu P-H1299 hücrelerinden daha düşük bulunmuştur. Ancak tüm hücrelerdeki PCNA, siklin D1, Bax, Bcl-2, ATM ve ATR mRNA ekspresyonu seviyeleri kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında en fazla ATM ve ATR genlerinin mRNA ekspresyonunun arttığı görülmüştür. Sonuç olarak katekolün her ne kadar çoklu sinyal yolu ile apoptotik etkiye neden olduğu görülse de en etkili uyarılan sinyal yolunun DNA'da tek ve çift zincir kırıklarının varlığı ile açıklanan ATM ve ATR sinyal yolu olduğu ortaya konmuştur.