Kordon kökenli mezenkimal kök hücrelerinin hepatosit hücrelerine farklılaştırılmasının optimizasyonu

Karaciğer hastalıkları dünyanın ve Türkiye'nin ciddi sağlık problemlerinden biridir. Son yıllar da siroz, karaciğer kanseri gibi giderek artan karaciğer hastalıkları oldukça yaygın olup çoğu hepatosit fonksiyon kaybına neden olmaktadır. Günümüzde karaciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan çeşitli yöntemler uygulanmasına rağmen, halen karaciğer tedavisine yönelik etkin bir çözüm bulunamamıştır. Bu nedenle de son yıllar da karaciğer hastalıklarına yönelik kök hücre temelli alternatif tedavi yöntemleri geliştirilmektedir. Günümüzde karaciğer hastalıklarının tedavisine yönelik kök hücre çalışmalarında; kemik iliği, adipoz doku, kordon kanı ve kordon matrisi (Wharton jeli) gibi farklı kök hücre kaynakları kullanılmaktadır. Çeşitli yöntemler kullanılarak izole edilen kordon kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerin yüksek çoğalma potansiyeli, düşük immünojeniteleri ve sahip oldukları farklılaşma kapasiteleri karaciğer hastalıklarının tedavisine yönelik uygulamalarda kullanılabilmesi açısından son derece umut vericidir. Karaciğer hastalıkları tedavisi için mezenkimal kök hücrelerden hepatosit hücrelerine farklılaştırmada çeşitli sitokinler, büyüme hormonları ve kimyasal ajanları içeren farklı protokoller kullanılmıştır. Ayrıca farklı kaynaklardan izole edilen mezenkimal kök hücrelerin hepatosit hücrelerine farklılaşma potansiyelleri de aynı değildir. Mezenkimal kök hücrelerin hepatosit hücrelerine farklılaşma potansiyeli bir taraftan izole edildiği kaynak çeşitliliğine bağlı olarak değişirken, diğer taraftan da farklılaşmada kullanılan hepatojenik sitokinler, büyüme hormonları ve diğer kimyasal ajanların uygulanma kombinasyonlarına bağlı olarak değişmektedir. Buna göre de şimdiye kadar mezenkimal kök hücrelerin hepatosit hücrelerine farklılaştırılmasına dayalı çeşitli çalışmalar bulunmasına rağmen, henüz daha etkin bir protokol geliştirilememiştir. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; insan kordon kanından, kordon veninden ve kordon matrisinden (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonunun, devamlı kültürünün ve kriyoprezervasyonunun yapılması, aynı zamanda kordon matrisinden (Wharton jeli) elde edilen mezenkimal kök hücrelerin hepatojenik hücrelere farklılaştırılması için ilk kez olarak daha etkin protokolün geliştirilmesi ve geliştirilen bu protokole dayanarak ülkemizde ilk kez olarak kordon matrisi kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerden hepatojenik hücrelerin elde edilmesi olmuştur. Ayrıca, doku mühendisliğinde kullanılmak üzere titanyum dioksit, titanyum gümüş, gümüş ve çinko gibi çeşitli nanopartiküllerin ilk kez olarak kordon matrisinden elde edilen mezenkimal kök hücreler üzerindeki etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Deneylerde; farklı izolasyon (Ficoll, enzimatik, eksplant), mikroskobik, kültür, hücre sayımı ve canlılık tayini 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT), histolojik (Periyodik Asit Shift Boyası), moleküler (Eş Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve Flow Sitometrik yöntemler kullanılmıştır. Veriler, SPSS version 15.0 for Windows programı ile değerlendirilerek ve p < 0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir. Elde edilen mikroskobik ve Flow Sitometrik analizler sonucunda; kordon matrisinden (Wharton jeli) eksplant yöntemiyle kısa sürede, fazla miktarda, enzim kullanmadan sağlıklı mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu gerçekleştirildi. Histolojik ve moleküler sonuçlar doğrultusunda; 20 ng/ml bFGF, 50 ng/ml HGF, 10 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml EGF, 1 µM/L Deksamethazon, 5 mM Nikotinamid, 50 mg/ml ITS, 20 mM Napiruvat içeren % 10 FBS eklenmiş 1:1 oranında ki DMEM-F12 (Fenol red'siz)-IMDM medyum farklılaştırma kültür ortamı olarak, 10 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml HGF, 50 ng/ml OSM, 5 mM Nikotinamid, % 1 DMSO, 50 mg/ml ITS, 1 µM Deksamethazon içeren %10 FBS eklenmiş 1:1 oranında ki DMEM (Düşük Glukozlu Fenol red'siz)- William's E medyum olgunlaşma kültür ortamı olarak kullanılarak geliştirdiğimiz bu yeni protokol ile en etkin hepatojenik farklılaşma gerçekleştirildi. Diğer protokollerle karşılaştırıldığında, geliştirdiğimiz bu etkin yeni protokol ile elde edilen hepatojenik hücrelerin, kontrol (mezenkimal kök hücre) ve hepatosit (Hep 3B) hücre gruplarına göre; yapılan Eş Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu sonucunda albumin (ALB) ve alfa feto protein (AFP) gen ekspresyon düzeylerinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde en çok eksprese olduğu belirlendi (PANAVO ***<0,001). Sitokeratin 18 (CK-18) gen ekspresyonunun ise, hepatosit (Hep 3B) hücre grubuna kıyasla yaklaşık 4 kat arttığı, kontrol (mezenkimal kök hücre) grubuna kıyasla yaklaşık 2 kat arttığı görüldü. Sonuçta mevcut protokollerden farklı olarak geliştirilen bu yeni protokol ile, kordon matrisi kökenli mezenkimal kök hücrelerden hepatosit özelliklerine daha çok sahip hepatojenik hücrelerin farklılaştırılması gerçekleştirildi. Ayrıca, MTT sonuçları da; titanyum, titanyum gümüş, gümüş ve çinko nanopartiküllerinin yüksek dozlarının kordon kökenli mezenkimal kök hücreler için toksik etki yaptığı ve hücrelerin proliferasyonunu azalttığı belirlendi. Kordon kökenli mezenkimal kök hücrelerde titanyumun EC50 değeri 20.58, titanyum gümüşün EC50 değeri 33.3, gümüşün EC50 değeri 12.11, çinkonun EC50 değeri 3.1 'dir. EC50 değeri en yüksek olan titanyum gümüş nanopartikülünün toksik etkisinin en az olmasından dolayı kordon matrisinden (Wharton Jeli) elde elde edilen mezenkimal kök hücreler için kullanımın en uygun olduğu tespit edildi. Yapılan çalışmalar sonucunda karaciğer hastalıklarına yönelik kök hücre çalışmaları alanında ilk kez olarak kordon matrisi kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerin hepatojenik (hepatosit benzeri) hücrelere dönüştürülmesinde en etkin protokol geliştirilmiş oldu. Geliştirdiğimiz bu yeni protokol ile ülkemizde ilk kez olarak kordon matrisi kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerden hepatojenik (hepatosit benzeri) hücreler elde edilmiş oldu. Sonuç olarak; kordon matrisi kökenli mezenkimal kök hücrelerin hepatositlere farklılaştırılması için geliştirilen bu yeni protokol diğer kaynaklardan elde edilen mezenkimal kök hücreler içinde uygulanabilir. Bu yöntemle elde edilen hepatojenik hücreler karaciğer hastalıklarında hücre temelli tedavilerde, aynı zamanda da doku mühendisliğinde yeni ilaçların geliştirilmesinde ve toksisite araştırılmalarında, ayrıca toksik olmayan konsantrasyonları belirlenmiş olan titanyum, titanyum gümüş, gümüş ve çinko nanopartiküllerinin de ileri de ilaç, aşı ve doku mühendisliğinin çeşitli alanlarında kullanılabileceği önerilebilir.