Kumarin türevlerinin Bacteroides fragilis'in D-LDH enzimi üzerine olan inhibitör etkisinin belirlenmesi

Bacteroides fragilis insan kolon florasında doğal olarak bulunan anaerobik bir bakteridir. B. fragilis'in D-laktat dehidrogenazı (BfD-LDH), D-laktatın piruvata dönüşümünü katalize eden çok önemli bir enzimdir ve anaerobik glikolizi düzenler. B. fragilis ile ilgili yapılan son çalışmalar kolon kanseri ile ilişkisini açığa çıkarmıştır. Dünya genelinde B. fragilis'in enterotoksijenik suşunun sebep olduğu enfeksiyonlara karşı antibiyotik direnç geliştiği bildirilmiştir. Bu nedenle, bu enfeksiyonların tedavisi için yeni yaklaşımlar bulunmasına yönelik çalışmaların yapılması zorunludur. Bu tez çalışmasında, B. fragilis'in kolon florasındaki enfeksiyonunun baskılanması için BfD-LDH'ın inhibe edilmesi hedeflenmiştir. Laboratuvar grubumuz tarafından klonlanmış ve protein ekspresyonu gerçekleştirilmiş olan BfD-LDH'ı saflaştırmak için Ni-NTA agaroz kolonları ile afinite kromatografisi yöntemi uygulanmıştır. SDS-PAGE analizi ile enzimin yüksek miktarda ve %95 üzeri saflıkla elde edildiği gösterilmiştir. Daha önce sentezlenmiş olan ve -hidroksi, -asetoksi ve -metoksi grupları taşıyan 29 adet kumarin türevinin BfD-LDH üzerindeki inhibe edici etkileri spektrofotometrik olarak incelenmiştir. Yapılan taramada 15 kumarin türevinin 10 µM ve altında IC50 değeri ile BfD-LDH'ı yüksek seviyede inhibe ettiği bulunmuştur. En düşük IC50 değerini gösteren 3 kumarin türevi için (K5: 0,47 µM, K21: 0,57 µM ve K23: 0,057 µM) enzim inhibisyonu mekanizması ve enzimli reaksiyonun kinetik parametreleri ayrıntılı olarak incelenmiş ve bu bileşikler ile BfD-LDH inhibisyonu mekanizmasının yarışmasız inhibisyon olduğu bulunmuştur (Ki değerleri sırasıyla; 0.4532, 0.5183 ve 0. 3603 µM). In silico analiz için ChemDraw V10 programı ile kumarin türevlerinin kimyasal yapıları çizilmiş ve MarvinSketch V6.2 programı ile konformasyonları gösterilmiştir. Kumarin türevlerinin docking çalışmaları Molegro Virtual Docker programı ile gerçekleştirilmiştir. Yapılan docking çalışmaları sonucunda kumarin türevlerinin enzimin aktif kalıntıları ile etkileşip etkileşmedikleri gösterilmiştir. Bu çalışma BfD-LDH üzerine yapılan ilk inhibisyon çalışmasıdır. Bulunan yüksek inhibisyon sonuçları ve enzimin insanda eşdeğerinin olmaması daha ileri in vivo çalışmalar için ümit vericidir.