Kurkumin yüklü PLGA-DSPE hibrit nanopartiküllerin hazırlanması, karakterizasyonu ve in vitro etkinliğinin incelenmesi

Poly (D, L Lactic-co-Glycolic acid) (PLGA) biyouyumlu, biyobozunur ve FDA onaylı bir biyopolimerdir. Bu polimer, emülsiyon- solvent evaporasyon yöntemi ile nano miseller hazırlanmasının kolay olması ayrıca, hidrofobik ilaçların taşınması için elverişli olması ile diğer biyouyumlu polimerlerden ayrılmaktadır. Kurkumin ise, Curcuma longa rizomlarından izole edilen, çok sayıda önemli biyolojik aktiviteye sahip bir doğal bileşiktir. Bu biyoaktivitelerin arasında ilk olarak kanser hücrelerinin kurkumin etkisiyle proliferasyonunun inhibe edilmesi ve apoptoza yönelmesi gelmektedir. Buna ek olarak kurkuminin kemoterapi ilaçlarının indüklediği direnç ile ilişkili genlerin aktivasyonunu ve proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Bu proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürmek, kanser hücrelerinde ortaya çıkan kemoterapi direncinin gelişmesini engellemeyi ve kemoterapi ilacının daha etkili hale gelmesini sağlamaktadır. Daha önce laboratuvarımızda yapılan PLGA nano-misellerine 125 g/mL kurkumin yüklemiş ve uygulandığı kanser hücrelerinde NF-κB seviyelerindeki değişim incelemiştir. Bu çalışmanın sonucunda kurkumin'in NF-κB seviyesini düşürmekte başarılı olduğu ancak PLGA nano-misellerinin bu proteinin tüm alt birimlerini etkin şekilde düşürmek için gerekli olan konsantrasyona ulaşamadığı fark edilmiştir. Bu sorun iki sebepten kaynaklanmış olabilir. Kurkumin NF-κB'nin tüm alt birimlerinin seviyesini düşüremeyen bir bileşiktir veya PLGA'nın taşıdığı kurkumin miktarı bu etkinliği elde etmek yetersizkalmaktadır. Bu tez çalışması ile amacımız, PLGA'nın kurkumin taşımak için sahip olduğu hidrofobik kapasiteyi yine biyouyumlu ve FDA onaylı bir fosfolipit olan DSPE ile arttırmaktır. Bunun için "Emülsifikasyon- Solvent Evaporasyon" ve "Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi" olmak üzere iki farklı yöntem ile PLGA-DSPE hibrit nano-miselleri hazırlandı, hesaplamalı moleküler modelleme yöntemleri ile polimer ve lipidin uyumu incelenmiş ve fizikokimyasal olarak karakterizasyonu tamamlandı. Ardından kurkumin taşımak için hidrofobik kapasitesi geliştirilen PLGA'nın bir kemoterapi ajanı olan 5 – Flourourasil (5-FU) kullanıldığında biyolojik etki açısından iyileşme davranışları in vitro olarak incelenmiştir. "Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi" yöntemi ile hazırlanan nanomiseller ile taşınan kurkumin miktarının 250 g/mL'ye kadar yükseldiği başarılı bir şekilde gösterilmiştir. Kurkumin yüklü nano-misellerin fizikokimyasal karakterizasyonu Dynamic Light Scattering (DLS) FT-IR, Differential Scanning Chalorimetry (DSC) ve HPLC ile gerçekleştirilmiştir. DLS yöntemi ile boyutu 120 nm (sayıca %) olarak tespit edilen nano-misellerde DSC ve FT-IR yöntemleri ile kurkumin'in başarılı bir şekilde nano-partikülün çekirdek kısmına yerleştiği ve DSPE'nin PLGA'nın tüm fonksiyonel grupları ile etkileştiği tespit edilmiştir. HPLC yöntemi ile oluşturulan hibrit nano-miselin içinde tuzağa düşürülen kurkumin miktarının yüzde enkapsülasyon etkinliği (%EE) %92,006 ve yükleme kapasitesi (%DL) %7,301 olarak ölçülmüştür. Kurkumin'in hibrit nano-miselden salım mekanizması incelenmiş ve Korsmeyer–Peppas modelinin en uygun model olduğu tespit edilmiştir. Buna göre kurkumin'in hibrit nano-misellerden salımının nano-taşıyıcının şişmesine bağlı olarak, difüzyon ile gerçekleştiği ortaya çıkmıştır. Elde edilen optimize formülasyonun stabilitesi yukarıda bahsedilen analiz yöntemleri ile, çeşitli ortam (oda sıcaklığı, liyoflizasyon sonrası ve besiyerinde) ve çeşitli sürelerde incelenmiş ve hazırlanan formülasyonun yüksek ölçekte üretim sırasında pazarlamaya uygun olduğu tespit edilmiştir. Tüm bunlarla birlikte kurkumin yüklü DSPE-PLGA hibrit nano-miselleri için hesaplamalı moleküler modelleme çalışmaları (kuantum kimyasal küme modelleri ve periyodik DFTB+ hesaplamaları) gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak oluşturulan PLGA, DSPE ve kurkumin matriksinde kurkumin'in sadece DSPE veya PLGA ile değil, her ikisi ile etkileşimde olduğu, DSPE'nin PLGA zincirlerini bir arada tutmakta büyük etkisi olduğu ve üçlü sistemin birlikte oldukça kararlı bir sistem ortaya çıkardığı tespit edilmiştir. Bu sonuç stabilite çalışmaları ile uyumludur. Son olarak 250 mg/mL kurkumin taşıyan optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin in vitro biyolojik etkisi LoVo insan kolorektal kanser hücre hattı ve sağlıklı kolon hücre hattı CCD-1072Sk üzerinde incelenmiştir. Bunun için öncelikle 5-FU'nun IC50 değeri 440.9 M olarak hesaplanmış ve ilerleyen deneylerde 5-FU'nun bu konsantrasyonu kurkumin yüklü optimize hibrit nano-miseller ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Optimize formülasyonun kanser hücreleri üzerindeki apoptoz etkisi akridin turuncusu (AO)/ etidyum bromür (EB) çift boyaması, DAPI boyama, floresan mikroskop incelemesi ve akış sitometrisi cihazında Annexin V-FITC ve PI boyama ile gerçekleştirilmiş ve optimize formülasyonun apoptoz üzerindeki etkisi serbest kurkumin'e kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bunu takiben Western Blot yöntemi ile apoptotik protein artışı incelenmiştir. P53 proteininin, NP ile 5-FU kombinasyon uygulaması sonucu oluşan protein ekspresyon düzeylerinin yalnızca NP uygulamasına kıyasla anlamlı düzeyde yüksek olduğu sonucu elde edilmiştir. Bununla uyumlu olarak kemoterapi ve hibrit nano-taşıyıcının taşıdığı kurkumin'in kombine kullanımında hücre içi rekatif oksijen türleri (ROS) oranlarında anlamlı artış gözlenmiştir. Son olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin kurkumin'in hücre içine girişindeki etkisi incelenmiştir. Sonuç olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-miselinin PLGA'nın kurkumin taşıma kapasitesinin başarılı bir şekilde iki katına çıkardığı tespit edilmiş ve 5-FU ile kombine tedavide kemoterapinin etkinliğini arttırdığı tespit edilmiştir. In vivo çalışmalar ile hazırlanan optimize hibrit nano-formülasyonun etkinliğini incelemek araştırmanın bir sonraki basamağı olarak tasarlanmıştır.