Kütle spektrometrisi ile proteinlerin ubikitinasyon bölgelerinin düşük derişimlerde belirlenmesi

Proteinlerin; fosforilasyon, glikozilasyon, asetilasyon, ubikitinasyon ve diğer post-translasyonel modifikasyonları birçok hücresel işlevin ve hücre içi sinyal olaylarının düzenlemesine olanak sağlamaktadır. Ubikitinasyon; birçok protein grubunun düzenlenmesi ve bozunmasında anahtar rol oynayan, çok fazla rastlanan bir post-translasyonel modifikasyon türüdür. Proteomiks alanında ubikitinasyon ve poliubikitinasyon analizleri, en aktif çalışma alanlarından biri olarak öne çıkmaktadır. Kanser, metabolik sendromlar, nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer, Parkinson, Huntington), inflamatuar bozukluklar, otoimmünite (kendi dokularındaki antijenlere karşı antikor oluşması), enfeksiyon ve kas erimesi gibi hastalıkların başlangıç ve ilerlemelerinde ubikitinasyon aktif olarak rol almaktadır. Ubikitinasyona uğramış protein fonksiyonlarının anlaşılması için ubikitinasyon bölgelerinin tespit edilmesi ve bağlanma mekanizmalarının aydınlatılması, hastalıkların teşhis ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde son derece önemlidir. Hücrelerde, ubikitinasyon post-translasyonel modifikasyonuna uğramış protein düzeyi onların original haldeki derişimlerine göre oldukça düşük olduğundan, ubikitinasyon tayini ve ubikitinasyon bölgelerinin tespiti oldukça zordur. Ubikitinasyon bölgelerinin yüksek hassasiyet ile tayin edilmeleri, uygun bir zenginleştirme metodunu takiben gerçekleştirilen analizlerde en hassas ve güvenilir sonuçların elde edilebileceği kütle spektrometrik teknikler kullanılarak yüksek hassasiyette yapılmaktadır. Tez kapsamında, öncelikle Histon 2B peptidi ve ubikitinasyona uğramış Histon 2B peptidi model olarak alınmış ve araştırma laboratuvarımızda bulunan matriks yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşmalı uçuş zamanlı kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) kullanılarak çeşitli örnek hazırlama ve cihaz analiz parametreleri optimize edilerek çalışmayla ilgili temel analizler gerçekleştirilmiştir. Yapılan analizler sonucunda referans biyomoleküllere ait spektrumlardaki peptit sinyallerinin yorumlanması ile ubikitinasyon post-translasyonel modifikasyonun kütle spektrometrik olarak izlenmesinin mümkün olduğu tespit edilmiştir. İleri çalışmalarda ise, ubikitinasyon enzimi olarak kanser hücresi ölümünde ubikitinasyonun rolünü aydınlatmak için bir E3 ubikitin protein ligazı olan UHRF1 (Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) seçilmiştir. UHRF1_siRNA' ları verilmiş RKO hücreleri ve kontrol RKO hücreleri üzerine yürütülen eş zamanlı proteomiks çalışmalarında yapılan veri analizlerinin sonuçlarına göre, siRNA eklenen hücrelerde UHRF1 down-regülasyonu gözlenmesi, UHRF1_siRNA'larının UHRF1'e özgü olduğunu kanıtlamıştır. İmmünoafinite çöktürme ile gerçekleştirilen zenginleştirme çalışmalarından sonra tespit edilen ubikitinasyona uğramış proteinlerin sayısında büyük bir artış gözlenmiştir. Dolayısıyla tripsin parçalaması sonucu elde edilen peptitler üzerinde ubikitinasyon tayinine özgü etkin bir zenginleştirme işleminin gerçekleştirilmesinin şart olduğu sonucuna varılmıştır. Tezin son kısmında, amin fonksiyonel grupları içeren sol jel, poli-L-Lizin immobilize sol-jel, poli-L-arjinin immobilize sol-jel, poli-L-ornitin immobilize sol-jel, titanyum, zirkonyum ve tantalyum temelli sol-jeller, sülfonil grubu içeren anyonik yüzey, ipek ve son olarak pamuk malzemeleri monoubikitinasyona uğramış Histon 2B peptidinin parçalanma ürünleri ile inkübe edilmiştir. Bu zenginleştirme amaçlı gerçekleşetirilen deneyler sonucunda, ubikitinasyon bölgesine ait sinyalin en iyi gözlendiği malzemenin sülfonil grubu içeren anyonik yüzey malzemesi olduğu ve ileri çalışmalarda ubikitinasyona uğramış peptidlerin zenginleştirilme işleminde kullanılabileceği tespit edilmiştir.