Laktoperoksidaz enziminin kefirden afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması ve bazı kimyasallar üzerine etkilerinin araştırılması

Laktoperoksidaz enzimi (LPO: E.C.1.11.1.7), memeli sütlerinde bulunan bir peroksidazdır. Sütten elde edilen peroksidaz enzimi ile tükürük ve gözyaşında bulunan peroksidazlar arasında benzerlik bulunmaktadır. Laktoperoksidaz yaklaşık 78 kDa molekül ağırlığında, %8-10 karbonhidratlık bir glikoproteine sahip, 612 aminoasit içeren tek bir polipeptitten oluşur. Yapısında prostetik grup olarak hem bulunur. LPO antibakteriyel özelliklere sahip bir oksidoredüktaz grubu enzimidir. Bu çalışmada Jersey cinsi sığır sütünden ve geleneksel yolla aynı sütten elde edilen kefirden laktoperoksidaz (LPO) enzimini, afinite kromotografisinin bir türü olan hidrofobik etkileşim kromotografisi yöntemi geliştirilerek saflaştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla LPO enzimleri önce toluen ve ardından amonyum sülfat ile protein çöktürmesi uygulanarak kısmi saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Süt laktoperoksidaz enziminin en iyi aktivite gösterdiği amonyum sülfat konsantrasyon aralığı %60 ve kefir laktoperoksidaz enziminin en iyi aktivite gösterdiği amonyum sülfat konsantrasyon aralığı %50 olarak tespit edilmiştir. Ardından Sepharose 4B-L-tirozin-1-naftilamin jeli kullanılarak, süt LPO enzimi %24.08 verimle 220.8 kat; kefir LPO enzimi %39.91 verimle 399.20 kat saflaştırılmıştır. Enzimlerin saflığı SDS-PAGE elektroforez yöntemi kullanılarak kontrol edilmiştir. Kefir laktoperoksidaz ve süt laktoperoksidaz için 80 kDa civarında tek bant elde edilmiştir. Süt LPO ve kefir LPO enzimlerinin Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk yönteminden yararlanarak bulunmuştur. ABTS substratı için süt LPO için Km değeri 0.166±0.071 mM ve Vmax değeri 238.095±0.71 EU/mL; kefir LPO için Km değeri 0.088±0.016 mM ve Vmax değeri 294.117±0.89 EU/mL olarak belirlenmiştir. Çalışmanın son aşamasında, bazı kimyasalların elde edilen saf süt ve kefir LPO enzimleri üzerine etkileri incelenmiştir. Enzimin spesifik inhibitörleri olan sülfanilamid ve sülfaguanidinin süt LPO ve kefir LPO enzimleri üzerine inhibisyon etkileri çalışılmıştır. Süt LPO enzimi üzerine sülfanilamid ve sülfaguanidinin IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 3.41±0.54, 1.15±0.32 ve 0.019.10-4±0.009.10-4, 0.035.10-5±0.003.10-5 µM bulunmuştur. Kefir LPO enzimi üzerine sülfanilamid ve sülfaguanidinin IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 4.24±0.67, 1.9±0.59 ve 0.044.10-4±0.002.10-4, 0.065.10-5 ± 0.004.10-5 µM bulunmuştur.