Leishmania tropica parazitlerinden elde edilen immünojen moleküllere karşı tanıda kullanılmak üzere hibridoma teknolojisine dayalı antikor üretilmesi

Ülkemizin ve dünyanın ciddi halk sağlığı problemlerinden biri olan leishmaniasis zoonotic bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü'nün yayınladığı veriler çerçevesinde her yıl yeni 2 milyon vaka ile beraber dünyada 350 milyon kişi bu hastalığın tehditi altında yaşamakta olup, 90 ülkede endemiktir. Leishmaniasisin kutanöz, mukokutanöz ve visseral olmak üzere üç formu mevcuttur. Türkiye'de kutanöz leishmaniasise Leishmania tropica, mukokutanöze Leishmania major, visseral leishmaniasise ise Leishmania infantum sebep olmaktadır. Tedavide kullanılan antimonyal ilaçlara ve vektörlerde ise kullanılan insektisistlere karşı direncin gelişmesi, şuana kadar etkin bir aşının geliştirilememesi ve ayrıca tanıdaki sorunların şimdiye kadar giderilememesi hastalığın geniş yayılım göstermesinin nedenleri arasında yer almaktadır. Leishmaniasisin tanısında mikroskobik, kültür ve mikrokültüre dayalı sistemler, serolojik ve moleküler yöntemler kullanılmaktadır. Mevcut tanı yöntemlerinin hastalığın farklı formlarına ve parazitin türüne karşı gösterdikleri duyarlılıkları birbirinden farklıdır. Bu yöntemler arasında daha yaygın kullanılan klasik mikroskobik yöntemlerin temelini Giemsa boyalı preperatlar oluşturmaktadır. Ucuz ama kısmen uygulanabilir olan mikroskobik yöntemlerin dezavantajı, örneklerin içerdiği parazit sayısına bağlı olarak duyarlılık derecesinin değişimidir. Diğer bir yöntem olan kültür yönteminde, kapalı bir sistem içerisinde parazit gelişimin gözlenmesi mümkün olsa da bu hastalığın tanısının koyulabilmesi için 15-30 günlük uzun sürelere gereksinim duyulmaktadır. Kültür yöntemlerinin bu dezavantajına karşın, sonraki yıllarda geliştirilen mikrokültür yöntemi ile daha kısa sürede (1-5 gün) daha yüksek duyarlılık sağlanmıştır. Bu yöntem sadece leishmaniasisin tanısında değil, donör kanlardan elde edilen örneklerde, aşı geliştirilmesinde, farelerin sakrifiye edilmeden çalışılmasında, kök hücre izolasyonu ve helikobakter tanısında da örnek bir model oluşturmuştur. leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere geliştirilen izoenzim analizleri, polimeraz zincir tepkimesi, gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi gibi moleküler tabanlı yöntemler de kullanılmaktadır. Bu yöntemlerinde dezavantajlarının başında, parazite bağlı duyarlılıkla beraber pahalı olması ve uzmanlık gerektirmesi gelmektedir. Leishmaniasis hastalığında, parazitin yüzey antijenlerini hedef alan antikor temelli diagnostik önem teşkil eden serolojik yöntemlerde bulunmaktadır. Erken tanı için avantaj sağlayan bu serolojik yöntemlerin başında immünofloresans boyama tabanlı IFAT, ELİSA ve rK39 kitleri gelmektedir. Mevcut serolojik yöntemlerin temelini serumda bulunan antikorların tespiti oluşturmaktadır. Ticari olarak üretilen ve leishmaniasisin tanısında kullanılan rK39 kiti, visseral leishmaniasisli hastalarda daha yüksek duyarlılığa sahipken; kutanöz leishmaniasisli hastalarda duyarlılığın oranı %20 civarlarında kalmaktadır. Buna göre de kutanöz leishmaniasisde uygulanan serolojik yöntemlerin düşük duyarlılığı ancak lezyon bölgesinde parazite has antijenin bulunmasına dayandırılabilir. Dünya'da ve ülkemizde kutanöz leishmaniasisli hastaların tanısında kullanılmak üzere rK39 kitine benzer herhangi bir çalışmaya rastlamadık. Bu tarz test kitlerlerinin hazırlanmasının temelinde ise; hibridoma teknolojisine dayalı antikorların üretilmesi gelmektedir. Hibrodoma teknolojisi ile bir çok hastalığa karşı yüksek özgüllük ve afiniteyi sağlayan tanı sistemleri oluşturulmaktadır. Dünya'da leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisine dayalı çalışmalar daha çok üretilen antikorların çapraz reaksiyonlarını incelemekle kalmış, etkili bir tanı sisteminin geliştirilmesine ait herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Daha önce laboratuvarımızda tamamlanan yüksek lisans tez çalışması kapsamında visseral leishmaniasis etkeni L.infantum'a karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikor üretilmiştir. Bu alandaki çalışmaların yetersiz olmasının nedenlerinden biri de immün yanıt oluşturmada yaşanan zorluklardır. Leishmaniasise karşı yapılan hibridoma çalışmalarının ortak noktalarından biri de immünizasyon aşamasında Freund's adjuvanının kullanılmasıdır. Bu adjuvanın etkili ama toksik olduğu yapılan çeşitli çalışmalar ile belirtilmiştir. Sıklıkla kullanılan bu adjuvanın toksik özellikte olması yeni adjuvan gereksinimlerini beraberinde getirmektedir. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı, L.tropica parazitlerinin immünojen moleküllerine karşı kutanöz leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere hibridoma teknolojisine dayalı antikor üretilmesi ve çeşitli adjuvanların antikor üretimi üzerindeki etkinliğinin incelenmesi olmuştur. Amaca ulaşmak için Leishmania tropica parazitlerinden elde edilen yüzey antijen molekülleri ile aşılanan farelerin dalak hücrelerinden izole edilen B-lenfositleri ile kemik iliği kanser hücresi olan myelomaların füzyonu sonucunda oluşturulan hibridoma teknolojisini temel alan antikor üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu teknolojinin aşamaları arasında yer alan immünizasyonda, Leismania tropica tüm yüzey antijenleri ile literatürde sıklıkla kullanılan Freund's adjuvan kompleksi ve literatürden farklı olarak polimerik temelli, FDA onaylı ve toksik olmayan polioksidonyum (PO) adjuvanı kullanılarak, farelerde oluşan immün yanıtlar karşılaştırılmıştır. Yeterli yanıtların alındığı fareler servikal dislokasyon yöntemi ile kesilerek B-lenfositleri izole edilmiş ve kemik iliği kanser hücreleri olan myelomalarla füzyona uğratılmıştır. Hibridoma teknolojisi ile üretilen hibrit hücrelerin ürettikleri antikorlar ELİSA sistemi ile test edilmiştir. Ayrıca oluşturulan bu hibridoma hücrelerinin ürettikleri antikorlar yalnızca Leishmania parazitine karşı değil, aynı zamanda immünizasyon aşamasında kullanılan adjuvana karşı da oluşup oluşmadığı da ilk incelenmiştir. Hibridoma hücrelerinin ürettiği bu antikorun aynı zamanda parazitin yüzeyinde yer alan ve en immünojenik molekül olan lipofosfoglikana (LPG) ve Leishmania'nın diğer türleri olan L. major ve L. infantum'a karşı da oluşup oluşmadığı test edilmiştir. Bununla birlikte hibridoma hücrelerinin literatürde yer alan dondurma protokolleri izlenerek, kriyoprezervasyon öncesi ve sonrası ürettikleri antikor dinamiği incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar çerçevesinde, Freund's adjuvanı ile immünize edilmiş farelerde 6.İmmünizasyon sonrasında, PO ile immünize edilmiş farelerde ise 8.immünizasyon sonucunda antikor düzeyinin kontrole göre yaklaşık 5.5 kat arttığı saptanmıştır. Ayrıca aynı serum örneklerinde adjuvana karşı yanıt oluşup oluşmadığı da test edilmiştir. Buna göre de 8. İmmunizasyon sonucunda adjuvan olarak Freund's kullanılan farelerin Freund's'a karşı oluşturduğu antikor yanıtının kontrole göre yaklaşık olarak 3 kat arttığı; PO adjuvan olarak kullanıldığı farelerde ise 8.İmmunizasyon sonucunda bu adjuvana karşı oluşan yanıtın kontrole göre anlamlı bir değişme göstermediği saptanmıştır. Sonraki aşama olan füzyon sonucu oluşan hibridomaların seçici besiyeri içerisinde kültürü yapılmış ve ürettikleri poliklonal antikor yanıtları ELİSA yöntemi ile tespit edilmiştir. Bu antikor yanıtlarına göre hibridoma kültürünün 10. ve 20. günlerinde L.tropica'ya karşı poliklonal antikor oluşumu gözlenmiştir. Ayrıca bu antikorların etkinliği sadece antijen kaplamalarla değil; aynı zamanda adjuvan kaplamalar yapılarak da incelenmiştir. Freund's grubu hibridomalarının antijene özgü yanıtları 10. güne kıyasla 20. günde daha da azalmıştır. PO grubu hibridomalarının antijene özgü ürettikleri antikorlar 10. güne göre 20. günde daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Freund's grubu hibrit hücrelerinin ürettikleri antikorun yalnızca antijene spesifik olmadığı, aynı zamanda adjuvanın kendisine de bir yanıt oluşturduğu tespit edilmiştir. PO ile yapılan kaplama sonuçlarında ise hibridomaların ürettikleri antikor yanıtlarının 10. güne karşın 20. günde daha da azaldığı görülmüştür. Üretilen antikorların tüm parazit Leishmania ve Leishmania'nın en immünojenik yüzey molekülü olan LPG'ye karşı oluşturduğu yanıt tespit edilmiştir. Hibridomaların antikor üretme yetenekleri kriyoprezervasyon öncesi ve sonrasında karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve üretilen bu antikorların sadece L.tropica'ya özgü değil, L.infantum ve L.major'e karşı da farklı duyarlılıkta etki gösterdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmalar ışığında, üretilen antikorların ileride kutanöz leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere tanı kitlerinin geliştirilmesinde mümkün olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, deneysel değere de sahip olan bu antikorlar, parazitlerin besiyerleri içerisine eklenerek, üretildikleri antijenlerin, enfektivite özelliklerinin, promastigot-amastigot farklılaşması gibi evrimsel süreçlerinin incelenmesine olanak sağlamaktadırlar. Böylece bu çalışma kapsamında kutanöz leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisine dayalı antikor üretiminde L.tropica parazitlerden dondurup-çözme yöntemi ile elde edilen immünojen moleküllere karşı antikor üretilmesinde Freund's adjuvanına karşı ilk kez olarak toksik olmayan FDA onaylı PO daha etkin olduğu ortaya çıkmıştır.