Mannheimia haemolytica'dan lökotoksin üretimi için yeni besiyeri tasarımı ve ürün karakterizasyonu

Pnömonik pastörellozis hastalığına neden olan Mannheimia haemolytica'nın patojenezinde en önemli virulens faktörünün ruminant spesifik lökotoksin olduğu belirlenmiştir. Bu ekzotoksin, ruminantların lökositlerine toksik etki göstermekte ve ayrıca hastalığın ilerlemesinde de merkezi bir rol oynamaktadır. Lökotoksine karşı hayvan vücudunda geliştirilen bağışık yanıt, hastalığa karşı korumada etkilidir. Bu çalışmada M. haemolytica A1 (ATCC BAA 410) suşunun lökotoksin üretimini sağlayan besiyeri geliştirilmesi ve elde edilen lökotoksinin antijenik karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Lökotoksin üretiminin istatistiksel olarak tasarlanmasında 15 amino asit, 3 vitamin, 3 inorganik tuz ve 2 diğer bileşen olmak üzere toplamda 24 bileşenin etkisi değerlendirildi. Design Expert programı kullanılarak iki aşamalı Plackett-Burman tasarımı ile lökotoksin üretiminde düşük, olumlu ya da olumsuz etkileri olan bileşenler L-prolin, L-treonin, L-valin, L-glutamin ve NH4SO4 modelden çıkartıldı. Plackett-Burman tasarımı ikinci aşamasında L-arginin, L-izolösin, L-glutamik asit ve L-fenilalaninin olumlu veya olumsuz ancak etkisi yüksek bileşenler olduğu belirlendi. Ardından Central Composite Design (CCD) kullanılarak lökotoksin üretiminde bu bileşenlerin optimum derişimleri L-arginin; 0.69 g/L, L-izolösin; 1.4 g/L, L-glutamik asit; 3.59 g/L ve L-fenilalanin için 0,058 g/L olarak belirlendi. Gerçekleştirilen doğrulama deneyleri sonrasında da oluşturulan CCD modeli doğrulandı. Bakteriyel büyüme spektrofotometrik olarak, lökotoksin miktarı ise monoklonal antikor kullanılarak ELISA testi ile ölçüldü. Tasarlanmış besiyerinin ileri iyileştirilmesine yönelik KHPO4, NaHCO3 ve NaHPO4 kullanıldığında hücre büyümesini ve lökotoksin üretimini arttırdığı gözlemlendi. Tasarlanmış besiyeri RPMI-1640 ve BHI karşılaştırıldığında M. haemolytica'nın en iyi biyokütle üretimi BHI'de gözlemlendi. Ancak lökotoksin üretimi açısından değerlendiğinde BHI (16µg/ml), RPMI-1640 besiyeri (43µg/ml) ve tasarlanmış besiyerinden (18µg/ml) daha az lökotoksin üretimi sağladığı gözlemlendi. Bu çalışmada L-arginin, L-aspartik asit, L-glutamik asit, glisin, L-izolösin, L-lösin, L-lizin, L-fenilalanin ve tiamin HCl lökotoksin üretimine etkisi olduğu ilk defa gösterildi. Anahtar sözcükler: lökotoksin, Mannheimia haemolytica, istatistiksel optimizasyon, Plackett Burman tasarımı, merkezi bileşen tasarımı.