Applications of bacterial quorum quenching with Rhodococcus sp. BH4 for effective biofouling control in MBR

Hızla artan dünya nüfusu ve gelişen sanayi doğal kaynakları orantısız tüketmekte, bu tüketim iklim değişikliği ve su kıtlığı gibi önemli çevresel sorunları doğurmaktadır. Gittikçe artan su kıtlığına sürdürülebilir çözüm arayışlarından biri olarak öne çıkan membran biyoreaktörler (MBR), atıksuların membran sistemlerle arıtılıp sulama amaçlı olarak geri kazanımına dayanmaktadır. MBR sistemleri umut verici bir sistem olmasının yanı sıra tıkanmadan kaynaklı sınırlamalara da sahiptir. Tıkanmaların çoğu biyokütlenin membran yüzeyinde tutunarak birikmesinden kaynaklanan biyokirlenmedir. Mikroorganizmaların bulundukları ortamlar içerisinde birbirleri ile iletişime geçerek yeterli sayıya ulaştıklarında topluluk davranışlarına yöneldikleri tıp bilim dalının son yıllarda ortaya çıkardığı bilimsel bir gerçektir. Biyofilm oluşturmak da mikroorganizmaların en başta gelen topluluk psikolojisi davranışlarıdır. Bir araya gelerek dış etkilere karşı korunmalarını arttırmak ve yaşamsal döngülerini sağlayabilmek amacı ile "Yetersayı etkisi" (Quorum sensing) mekanizmasını kullanırlar. Ekolojik ortamlar içerisinde iletişim sinyallerini üretebilen türler olduğu gibi iletişim sinyallerini besin kaynağı olarak kullanabilen türler de bulunmaktadır. Bu türler kendi döngüleri için sinyal moleküllerini besin olarak kullanırken aslında bir araya gelmeye çabalayan türlerin birbirleri ve türler arasındaki iletişimlerini sekteye uğratmaktadırlar. Bu bakterilerin mekanizmalarının amaç doğrultusunda kullanılması da yeni keşfedilen "Yetersayı etkisi azaltımı" (Quorum quenching) olarak isimlendirilir. Bu mekanizmanın membran biyorektör işletimine adapte edildiği bu çalışma kapsamında etkili bakteri immobilizasyon konfigürasyonları denenerek MBR sistemlerinde biyokirlenmenin engellenmesi ve kontrolü için yenilikçi bir yaklaşım ortaya konulmuş ve araştırılmıştır. Bu amaçla gerçekleştirilen tez kapsamında, ilk olarak aktif çamur sistemlerinde quorum sensing mekanizmasının varlığı kanıtlanmıştır. Ardından, aktif çamurun bünyesindeki karışık kültürden quorum quenching etkisine sahip mikroorganizmalar izole edilmiş, bunların quorum quenching aktiviteleri saptanmış ve MBR sistemlerde uygulanabilirlikleri çeşitli immobilizasyon medyaları ile ortaya konulmuştur. İmmobilizasyon medyası olarak literatürde uygulamaları mevcut olan mikrobiyal vesel ve QQ boncuğun yanı sıra yeni bir medya da denenmiştir. Bu çalışmalarda ana amaç, kontrol MBR (konvansiyonel olarak işletilen MBR) ve QQ MBR (ilgili çalışmada kullanılan hedef immobilizasyon ürününün reaktöre ilave edilmesi ile işletilen MBR) lerinde oluşan transmembran basıncı (TMB)'nın profilleri arasındaki farkları elde ederek, QQ mekanizmasının sonuçlarını gözlemlemektir. Mikrobiyal vesel ve QQ boncuk uygulamaları değişik akı ve askıda katı madde işletme koşullarında gerçekleştirilmiş ve etkili quorum quenching mekanizması sonuçları elde edilmiştir. Bu tez kapsamında, QQ mekanizmasını gerçekleştirmek adına iki adet QQ bakterisi elde edilmiştir: Rhodococcus sp. BH4 ve Pseudomonas sp. 1A1. Rhodococcus sp. BH4 türünün QQ aktivitesinin Pseudomonas sp.1A1 türünün QQ aktivitesinden yüksek olduğu belirlenmiş ve tez kapsamındaki MBR işletimleri BH4 türü kullanılarak hazırlanan QQ ürünler ile gerçekleştirilmiştir. Iki farklı bakteri miktarı ile gerçekleştirilen mikrobiyal vesel çalışmalarında kullanılan mikrobiyal veseller mikrofiltrasyon boşluklu fiber membranları kullanılarak üretilmiş ve fiberlerin içerisine QQ bakterileri izole edilmiştir. Mikrobiyal vesellerin QQ aktivitelerinin belirlenmesinin ardından hareketsiz duracak şekilde mikrobiyal veseller reaktörlere yerleştirilmiştir. Mikrobiyal vesel ile QQ MBR işletiminde %44'lük bir QQ mekanizması başarısı gözlenerek TMB değerlerinin artması engellenmiştir. Kesikli olarak gerçekleştirilen QQ aktivitesi deneyineki QQ aktivitesi ile MBR işletiminde elde edilen başarı arasındaki %30'luk fark mikrobiyal veselin reaktör içerisinde hareketsiz durması gösterilebilir. Hareketsizlik, düşük F:M oranlarına ve laktonaz enziminin reaktördeki yayılımının kısıtlı kalmasına sebep olur. Mikrobiyal vesel çalışmalarının ardından QQ boncuklar ile işletimler gerçekleştirilmiştir. QQ boncuklar aljinat/polimer kullanılarak üretilmiş ve bünyelerine QQ bakteri immobilize edilmiştir. Üretimlerinin ardından reaktörlere ilave edilen boncuklar reaktörler içerisinde tam karışım halindeyken reaktörler işletilmiştir. Tüm boncuk çalışmaları sonucunda ortalama %90'lık bir TMB azalışı elde edilmiştir. Buna ek olarak, QQ boncuk kullanımı hücredışı polimeric maddelerin protein ve karbonhidrat içeriklerinin (EPSp ve EPSk) konsantrasyonlarını sırası ile %70 ve %38 oranlarında azaltmıştır. QQ boncuk kullanımının başarılı bir QQ mekanizması sağlayarak yüksek verimlerde TMB azalımına sebep olduğu söylenebilir. Bunlara ek olarak, tez kapsamında gerçekleştirilen bir diğer çalışma ise tek-adımlı MBR uygulaması ile aerobik ortamda azot gideriminin arttırılmasına yönelik bir işletimolmuştur. Çalışmanın çıkış noktası, üretilen bonukların çekirdek kısımlarının anoksik koşullara sahip olması fikridir. Bu bağlamda üretilen boncukların anoksik kısımları kullanılarak aerobik MBR işletimi süresince anoksik koşullarda gerçekleşebilen reaksiyonların da gerçekleşmesine olanak sağlanmıştır. Bu bağlamda gerçek evsel atıksu ile A2O prosesi doğrultusunda şletilen bir MBR tesisinin anoksik tankından anoksik aktif çamur alınarak polimer boncuklara immobilize edilmiştir. Bu çalışmanın yenilikçi tarafı ise, bu anoksik boncuklar ile QQ boncukların beraber MBR'ye ilavesi ile geliştirilmiş azot giderimi mekanizması ile QQ mekanizmasının birbirine etkisi olmadan pozitif sonuçlarını görmektir. Kontrol MBR boş boncuklar ile QQ MBR ise anoksik ve QQ boncuklar işe işletilmiştir. %94 gibi oldukça yüksek bir QQ etkisinin yanı sıra sırası ile %7 ve %21 seviyerlerinde kimyasal oksijen ihtiyacı (KOİ) ve toplam azot (TN) giderim verimi artışı elde edilebilmiştir. Sonuç olarak, tek-adımlı MBR işletimi ile, tesisin akım şemasından anoksik tankların da kaldırılabilmesi ya da çıkış standartlarının sağlanmasının zorlandığı mevsimlerde ek giderim veriminin sağlanması mümkündür. Mikrobiyal vesel ve QQ boncuk uygulamaları esnasında gözlenen uygulama avantajları ve dezavantajları doğrultusunda daha verimli ve pratik bir uygulama medyası tasarlanmış ve üretilmiştir. Üretilen yeni medya, döner mikrobiyal çerçeve (rotating microbial carrier frame-RMCF) olarak isimlendirilmiştir. RMCF, taşıyıcı bir çerçevenin üzerinin mikrofiltrasyon membran ile kaplanması sonucunda elde edilen odacıklara quorum quenching bakterilerin immobilize edilmesinin ardından bir karıştırıcının ucunda döndürülmek suretiyle uygulanır. RMCF inert bir malzemeden üretilerek, QQ boncuğun uygulama sırasında parçalanması dezavantajını, dönme hareketi ile mikrobiyal veselin uygulama sırasında düşük F:M oranı dezavantajını ortadan kaldırmaktadır. RMCF'nin üretimi ardından, tez kapsamında tasarlanmış olan bu yenilikçi ürün MBR işletimlerinde denenmiştir. Gerçekleştirilen kısa ve uzun süreli MBR işletimleri sonucunda RMCF kullanımı ile biyofilm oluşumunun %65'lik bir başarı ile engellenebildiği görülmüştür. Bunun yanısıra, RMCF kullanımı ile EPSp ve EPSk konsantrasyonlarında sırası ile %54 ve %29'luk azalma olduğu sonucu da elde edilmiştir. RMCF'nin MBR uygulaması sırasında quorum quenching etkisi ve dönme hareketi ile elde edilen fiziksel membrane temizleme etkisi kısa ve uzun süreli işletmeler ile ortaya konulmuştur. Yapılan testler sonucunda RMCF'nin biyofilm engelleme başarısının %20'sinin fiziksel yıkama etkisi olsuğu sonucuna varılmıştır. RMCF'nin hem quorum quenching hem de fiziksel yıkama etkisi mekanizmaları sayesinde başarılı bir şekilde biyofilm oluşumunu engellediği görülmüştür. Ayrıca, RMCF kullanımında immobilize bakterilerinin miktarının arttırılması ile MBR işletimindeki QQ verimi kolaylıkla arttırılabilmiştir. MBR tesisinin boyutu ve hedeflenen biyofilm azaltımı seviyesine göre RMCF'nin ve/veya RMCF bünyesindeki ceplerin sayısı arttrılarak kullanımı sağlanabilir. Quorum quenching bakteriler bulundukları ortamdaki sinyal moleküllerini parçalayarak grup davranışlarını ortadan kaldırır ve EPS salınımını azaltır. Sonuç olarak, mikrobiyal kültür bu durumdan etkilenebilir. Mikrobiyal çeşitliliğin tüm tez boyunca gerçekleştirilen QQ çalışmalarından etkilenip etkilenmediğini gözleyebilmek adına aktif çamurdan alınan kültür örnekleri ile denature gradyen jel elektroforez (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis-DGGE) analizleri gerçekleştirilmiştir. Kısa süreli QQ MBR işletimleri mikrobiyal çeşitlilik üzerinde herhangi bir etkide bulunmazken, uzun süreli QQ MBR işletimleri sonucunda reaktör içerisindeki tür çeşitliliğinin arttığı görülmüştür. Bu tür çeşidi artışı, sinyal molecullerinin parçalanması sonucu popülasyon dengesi içerisinde daha baskın olan türlerin iletişimlerini sürdürerek baskın olma durumlarını sürdürmelerinin engellenmesi ve popülasyon dengesi içerisinde çekinik olan türlerin üzerindeki baskının kalkması sebebi ile çoğalarak karışık kültürde daha görünür bir yüzdesel oran elde edebilmeleri olarak yorumlanabilir. Quorum quenching immobilizasyon medyalarının uygulamalarının sağladığı TMB azalımları sayesinde MBR işletimlerindeki enerji sarfiyatlarında azalma gerçekleşecektir. Tez kapsamında çalışmaları gerçekleştirilen üç değişik medyanın enerji sarfiyatı azaltımlarını ve üretim maliyetlerini ortaya koymak amacıyla maliyet analizi gerçekleştirilmiştir. Sadece enerji sarfiyatı azalımı göz önüne alındığında QQ boncuk kullanımı en faydalı ve mikrobiyal vesel kullanımı en az faydalı tercihler iken, biyo-ürünlerin üretim maliyetleri de yansıtıldığında RMCF kullanımı en faydalı ve mikrobiyal vesel kullanımı en az faydalı tercih olmaktadır. Üretim maliyetleri dikkate alınmadığında toplam maliyetteki azalım oranları mikrobiyal vesel, QQ boncuk ve RMCF için sırası ile %12, %24 ve %23 iken, üretimmaliyetleri dikkate alındığında bu yüzdeler sırası ile %6, %15 ve %21 olmaktadır. Bunun sebebi, RMCF'nin tasarımında göze alınan hususlar doğrultusunda üretim maliyetinin düşük olması ve uzun süreli işletimler sırasında immobilize bakterilerin rejenerasyonuna izin vermesidir. Tez kapsamında, MBR sistemlerde yenilikçi bir yaklaşım olan quorum quenching mekanizmasının uygulanabilirliği değişik bakış açıları ile ortaya konulmaya çalışılmıştır. Daha önce Çevre Mühendisliği uygulama alanları içerisinde oldukça yeni yer bulan ve literatürdeki mevcut uygulamaların kısıtlı olduğu quorum quenching mekanizması atıksu arıtımında kullanılmış ve birim atıksu arıtma maliyetleri önemli ölçüde azaltılabilmiştir. Anahtar kelimeler: Membran Prosesler, MBR, Biyojik Tıkanma, Bakterilerin Sinyalizasyonunun Engellenmesi, Enerji Tasarrufu