Menisküs doku mühendisliği için hibrit doku iskelelerin geliştirilmesi

Ortopedi cerrahisinde yürütülen en sık prosedürlerden biri ilerleyen yaş, yaranmalar ve çeşitli travmalar sonucunda meydana gelen menisküs lezyonlarının tedavisidir. Menisküs yaralanmalarındaki artma oranı, efektif bir onarım stratejisi geliştirilmesindeki acil ihtiyacın göstergesi olmaktadır. Doğal menisküs dokusunun mikroskobik ve makroskobik özelliklerini taklit edebilecek bir malzeme halen araştırılmaya devam etmektedir. Tez çalışması kapsamında, menisküs dokularının hücresizleştirilmesi ile ultrayapının korunduğu ve jel sisteminin entegre edilerek in situ çapraz bağlanabilir 3B iç içe geçmiş ağ yapılarından oluşan aselüler hibrit iskeleler elde edilmiştir. Tezin ilk kısmında deselülerizasyon metotlarının bir karşılaştırılması yapılmış; Süperkritik karbon dioksit (scCO₂) teknolojsi özgün bir yöntem olarak menisküs dokusunda denenmiştir. Fiziksel ön işlem, tripsin ajanı ile enzimatik ajitasyon ve SDS ajanı ile kimyasal ajitasyonu birleştirilerek % 82 genomik DNA azalmasını sağlayan optimum metot ortaya çıkarılmıştır. scCO₂ deselülerizasyonunda ise fiziksel ön işlem ardından tripsin ajanı ile penetrasyon derinliği artırılmış ve 37°C ve 4500 psi basınçta 1 saat prosesin gerçekleştiği grup % 76 DNA azalması ile optimum grup olarak belirlenmiştir. H&E ve DAPI boyamaları ile de grupların hücresizleştirildiği kanıtlanmıştır. Kolajen fiberlerin görüntülenmesi Masson Trichrome boyaması; proteoglikan yapılarının dokudaki varlığı Safranin/FCF boyaması ile sağlanmıştır. Histolojik çalışmalara senkronize olan biyokimyasal analizlerde ise Hidroksiprolin analizi ile kolajen miktarlarında değişme yaşanmadığı fakat DMMB analizinde GAG miktarında konvansiyonel deselülerizasyon grubunda % 42 ve scCO2 grubunda % 58 azalma yaşanmıştır. Her iki grupta da yaş ve kuru ağırlıklarında düşüşler yaşanırken scCO2 grubunda daha fazla azalma görülmüştür. SEM analizi ile kolajen demetlerinin organizasyonuna bakılmış ve deselülerizasyon sonucu minör gevşemeler bulunmuştur. GAG kaybına bağlı olarak deselülerize dokularda kompresif modulüsleri 22,8 ± 0,91 MPa'dan konvansiyonel deselülerize iskelede 15,26 ± 0,28 MPa ve scCO deselülerize dokuda 14,49 ± 0,48 MPa 'a düşüş yaşanmıştır. MTT elüsyon metodu ile sitotoksisite testi yapılan dokularda her iki grubun da % 75 üzeri hücre canlılığı tespit edilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde hibrit yapıların sentezlenebilmesi için polimer karışımları ve foto başlatıcı optimizasyonu yapılmıştır. Öncellikle jelatin molekülü metakrilik anhidrit eklenerek fonksiyonelleştirilmiş ve fonksiyonelleşme derecesi ¹HNMR analizi ile %75 bulunmuştur. LAP foto başlatıcısının absorbsiyonunun UVA ışık spektrumu ile çakışması hızlı bir in situ polimerizasyon sağladığı görülmüştür. GelMA ve desteklediği hidrojellere, LAP ve I2959 ile UV ışık altında çapraz bağlanarak oluşturulan yapılara, şişme, mekanik ve FTIR analizleri yapılmıştır. Tek fazdan ise 2 fazlı hidrojellerin daha stabil ve dayanıklı yapılar olduğu gözlenmiştir. HAMA molekülü 3. Fazı sağlaması adına yapılara eklenmiş ve en yüksek mekanik dayanımı sağlayan grup olmuştur. Nihai alternatif aselüler iskelenin üretilmesinde GelMA-Hibrit(G-Hibrit), PEGDMA/HAMA-Hibrit(PG-Hibrit) ve PEGDMA/GelMA/HAMA-Hibrit(PGH-Hibrit) yapıları LAP foto başlatıcısı ile oluşturulmuştur. Pre-jeller 5 mm kuru doku iskelesine emdirilmiş ve inkübasyonu sağlanmıştır. UV ışık ile arkalı önlü çapraz bağlanan gruplardaki kimyasal değişimler FTIR analizi ile incelenmiş ve karakteristik pikleri ortaya konulmuştur. Şişme testi ile çapraz bağlanan iskelelerdeki su alma kapasiteleri ölçülmüş ve çapraz bağlanan iskelelerin doğal dokuya yakın şişme fenomeni gösterdiği bulunmuştur. Basma analizi ile mekanik dayanımındaki iyileşmeler çapraz bağlı iskelelerde görülmüş ve buradan çapraz bağlama yoğunluğu en fazla olan PGH-Hibrit grubu bulunmuştur. Aselüler iskelelerin termal özelliklerinin saptanabilmesi için TGA ve DSC analizi yapılmış ve çapraz bağlanmış yapıların dekompozisyon ve protein denatürasyon sıcaklıklarında iyileşmeler gözlenmiştir. SEM ile doku iskeleleri içerisindeki 3B hidrojel yapılarının kolajen fiberleri kaplaması görüntülenmiştir. Çapraz bağlanan iskeleler PBS ve enzimatik degredasyonda % 25 altı ağırlık kaybı ile doğal dokuya benzer bir davranış sergilemiştir. Deselülerize ve hibrit iskelelere L929 hücre hattı kullanılarak Alamar Mavisi ile 1., 4. ve 7. günlerdeki hücre proliferasyonu incelenmiştir. 1. günde kontrol gruba göre % 80 üstü olan canlılık hibrit yapılarda 7. günde daha fazla yükseliş göstererek kontrol grup ile yakın olmuştur. Burada GelMA ve HAMA polimerinin hücrenin göçü ve proliferasyonunda daha etkin olduğu PGH-Hibrit grubunda görülen hücre canlılık oranının en yüksek olması ile anlaşılmıştır. Oluşturulan biyomalzemenin ayarlanabilen fizikokimyasal ve mekanik özellikleri ile menisküs doku mühendisliğinde kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.