Güncel moleküler teknikler ve teknolojiler kullanılarak RAB27A-/- gen tedavi alternatiflerinin optimizasyonu ve risk değerlendirilmesi

Griscelli Sendromu Tip 2 (GS-2), ekzositoz ve membran trafiğinde rol oynayan RAB27A geninde meydana gelen mutasyonların neden olduğu bir immün yetersizliktir. Bu tez kapsamında 1) GS-2 MKH'leri ve uPKH hatlarını kullanarak RAB27A'nın CRISPR/Cas9 gen düzenlemesinin etkinliğini; 2) LV vektörlerinin SFFV, PGK ve UCOE promoterlerinin kontrolünde MSC'lere aktarım ve RAB27A ekspresyon etkinliğini ve 3) immun yetmezlikli farelerde RAB27A'nın aşırı ifadesine bağlı potansiyel riskleri araştırılmıştır. RAB27A'daki mutasyonları hedef alan CRISPR/Cas9 elemanları tasarlanmış ve GS-2 MKH ve uPKH hatlarında gen düzeltme etkinliği test edilmiştir. Yeni bir GS-2 uPKH hattı oluşturulmuştur ve hücre kültürü/dondurma yöntemi optimize edilmiştir. RAB27A'nın CRISPR/Cas9 yöntemi ile düzeltilmesi mümkün olmasına rağmen kök hücrelerin hayatta kalım oranı düşük olarak bulunmuştur. GS-2 MKH'lere LV transdüksiyonu yapıldığında en yüksek ifadeyi SFFV'nin sağladığı ardından PGK ve UCOE'nun takip ettiği gösterilmiştir. RAB27A+ MKH'ler ve HKH'ler, immun yetmezlikli farelere nakledilmiştir ancak tümör oluşumuna neden olmamıştır. Ancak RAB27A'nın aşırı ifadesinin kök hücre fonksiyonunu etkilediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, GS-2 gen tedavisinin geliştirilmesinde CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme ve LV vektörü ile gen ekleme karşılaştırılmıştır. Gen düzenleme yeterli düzeyde onarım yapmasına rağmen CRISPR aktarım teknolojisi hücre canlılığının düşürmektedir. LV gen aktarımı kolay ve etkindir ancak RAB27A'nın yüksek ifadesi kök hücre fonksiyonu etkilemektedir. Bu nedenle, her iki yöntem de GS-2 için gen tedavisine yönelik olarak geliştirilebilir, ancak bu tedaviler klinik kullanıma hazır olmadan önce yöntemlerin optimizasyonu, hücre canlılığının arttırılması ve ifade seviyelerinin tam olarak ayarlanması gerekli olabilir. Anahtar Kelimeler: Griscelli Sendromu Tip 2, CRISPR/Cas9, lentivirüs, kök hücreler (*) Bu çalışma, Türkiye Cumhuriyeti Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu TÜBİTAK no: 219S675 ve Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi hibe no: TUK-2019-17760 ve THD-2022-19940 ile desteklenmiştir.