Pichia pastoris'te rekombinant insan dornaz alfa üretimi

Dornaz alfa (rhDNAseI), hücre dışı DNA'nın hidrolizini katalize eden doğada bulunan sayısız nükleazlardan birisidir. Birincil rolü nükleik asitleri parçalamak olan Dornaz alfa pankreas ve tükürük bezleri tarafından salgılanmaktadır. Dornaz alfa ilk olarak 1980'lerin sonunda insan pankreasından klonlanmıştır. DNA'yı seçici bir şekilde parçalayan rekombinant Dornaz alfa, kistik fibrozis (KF) hastalığı tedavisinde kullanılmakta olup viskoz mukusta bulunan DNA'yı hidrolize ederek akciğerlerdeki vizkozitenin azaltılması şeklinde etki mekanizmasını göstermektedir. Bu çalışmada, insan kaynaklı Dornaz alfa enzimi Pichia pastoris mayasında etanol ile indüklenebilen ve güçlü bir ekspresyon seviyesine sahip olan ADH2SNT5 promotoru kontrolü altında rekombinant olarak üreten bir suş geliştirilmiştir. Oluşturulan suşun Dornaz alfa üretim potansiyelinin laboratuvar ölçeğinde araştırılması ve endüstriyel üretime uyarlanabilmesi için ölçek büyütme çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, P. pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak Dornaz alfa enziminin ekspresyonu ilk kez bu çalışma kapsamında gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında öncelikle, Dornaz alfa enzimini kodlayan gen bölgesi, sentetik ADH2SNT5 promotorunu içeren vektöre klonlanarak pADH2SNT5αDornaz alfa ekspresyon vektörü elde edilmiştir. Hücre dışına sekresyon şeklinde gerçekleştirilen enzim üretiminde konak hücre olarak, PDI şaperon proteinini 4 kopya içeren P. pastoris MK115(PDI) kullanılmıştır. Farklı plazmid kopyası içeren klonlar farklı zeosin (100-1000 µg/mL) içeren plakalardan elde edilmiştir. Seçilen farklı kopya sayısında Dornaz alfa geni içeren klonlar ile üretim koşulları (28 ˚C sıcaklıkta ve pH 6.0, 225 rpm) BMEY besiyerinde erlenmayer ölçeğinde Dornaz alfa ekspresyonu yapılmıştır. Ekspresyon sonunda, üretim suşu olarak protein üretiminin en yüksek olduğu klon tek kopya gen içeren pADH2SNT5αDornaz alfa (MK115 PDI) #10 seçilmiştir. Daha sonrasında üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla erlenmayer koşullarında farklı sıcaklık ve pH (20-28 ˚C ve 3-7 pH aralığı) denemeleri yapılmıştır. Erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen 96 saatlik üretim sonunda, tüm üretim şartlarından elde edilen süpernatant örnekleri ile Dornaz alfa enzim aktivite testi yapılmış ve en yüksek verim pH 7.0 ve üretim sıcaklığı 24 ˚C olarak elde edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında ise oluşturulan klon ile, erlenmayer ölçeğinde belirlenen bazı parametreler (sıcaklık 24 ˚C ve pH 7.0) kullanılarak minimal (FM22) ve zengin (BMGY) besiyerinde fermentör ölçeğinde üretimler gerçekleştirilerek hızlı performans sıvı kromotografi (FPLC) yöntemi ile histidin etiketli enzimin saflaştırması yapılmıştır. Saflaştırma sonrası enzim aktivite değerleri, FM22 besiyerinde yapılan biyoreaktör üretimi sonucunda, 3525.42 U/ml (13559.32 U/mg) şeklinde bulunmuşken BMGY besiyerinde yapılan üretimde 3325.42 U/ml (15254.23 U/mg) olarak tespit edilmiştir. Çalışmanın ana hedefi, ticari olarak satılan Dornaz alfa enzimine muadil bir ürün geliştirilebilme potansiyelinin araştırılmasıdır. Bu bağlamda, yapılan bu çalışma ve ileride yapılacak olan karakterizasyon çalışmaları ile, memeli ekspresyon sistemi yerine maya hücre platformu kullanılarak ticari ürüne eşdeğer veya daha yüksek verimde bir ürün elde edilme potansiyeli mevcuttur. ANAHTAR KELİMELER: Dornaz alfa, fermantasyon, kistik fibrozis (KF), Pichia pastoris, rekombinant Dornaz alfa üretimi, rhDNAseI, ADH2SNT5 promotoru