Pichia pastoris'te rekombinant laktaz enzimi üretimi

Laktaz enzimi süt şekeri olarak bilinen laktozu katabolik reaksiyonlar ile parçalayarak glikoz ve galaktoz alt monomerlerine dönüştüren bir enzimdir. Diğer adıyla β-galaktosidaz olarak da bilinen laktaz enzimi özellikle gıda sanayisinde laktozsuz süt ve süt ürünleri üretmek amacıyla kullanılmaktadır. Toplumun geniş bir kesiminde bulunan laktoz intoleransı, laktozsuz ürünlere olan talebi artırmaktadır. Dünya nüfusunun yaklaşık %70' ini etkileyen bu hassasiyet, bebeklik döneminden başlayarak yetişkin insanlarda şişkinlik, bağırsak ağrısı, kusma ve ishal gibi gastrointestinal sorunlara neden olmaktadır. Hassasiyeti bulunan kişilerde yaşam konforunu önemli ölçüde etkilediği için günlük diyette gıda takviyesi olarak kullanımı mevcuttur. Günümüzde laktaz enzimi (β- galaktosidaz), endüstriyel ölçekte ağırlıklı olarak mikrobiyal fermantasyon ve rekombinant DNA teknikleri kullanılarak üretilmektedir. Bu üretim yöntemleri, yüksek verim, düşük maliyet ve sürdürülebilirlik gibi avantajlar sunmakta olup, literatür bilgisi veremezsin burada bu çalışma kapsamında enzimin Pichia pastoris (P. pastoris) mayasında etanol ile indüklenebilen mutant ADH2 promotoru kontrolünde rekombinant üretimi yapılmıştır. Çalışma kapsamında, sentetik kodon optimize olarak temin edilen Aspergillus oryzae (A. oryzae) laktaz geni sentetik SNT5 promotoru altına klonlanmış ve oluşturulan pSNT5α-Lac ekspresyon vektörünün P. pastoris MK115(PDI)suşuna transforme edilmiştir. Transformasyon sonrasında elde edilen P. pastoris MK115(PDI)#1 ve #2 klonları ile engelli erlenmayerde üretim ile sıcaklık (20-24-28℃) ve pH (3.0-7.0) optimizasyonu yapılmıştır. Laktaz enzim üretimi için optimum pH ve sıcaklık değeri pH 6 ve 28 ℃ olarak belirlenmiştir. Erlenmayer ölçekli üretimler sonucunda seçilen P. pastoris MK115(PDI) #1 klonu kullanılarak pH 6.0 ve 28℃ koşullarında hücre dışına sekresyon şeklinde yapılan üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi 6,800,000 U/mL, en yüksek toplam protein miktarı 512 mg/L olarak tespit edilmiştir. Erlenmayer koşullarında belirlenen optimum sıcaklık ve pH değerlerinde, FM22 besiyeri kullanılarak biyoreaktör ölçeğinde enzim üretimi geçekleştirilmiştir. Yaklaşık 95 saat süren fermantasyon sonucunda süpernatant örneklerinde enzim aktivite değerleri ve toplam protein miktarı sırasıyla 18,400,000 U/mL ve 3177 mg/L şeklinde tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda A. oryzae laktaz enziminin etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru altında P. pastoris MK115(PDI) suşunda üretimi yapılmış ve endüstriyel boyutta laktaz üretimi için biyoproses verileri elde edilmiştir